一种亲和层析介质、制备方法及其用途[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103586008 A(43)申请公布日 2014.02.19

(21)申请号 201310507901.5(22)申请日 2013.10.24

(71)申请人中国科学院过程工程研究所

地址100190 北京市海淀区中关村北二条1

号(72)发明人马光辉 张荣月 苏志国 叶佩丽

周炜清 李娟(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司

11332

代理人巩克栋(51)Int.Cl.

C07K 1/22(2006.01)

B01J 20/285(2006.01)B01J 20/30(2006.01)B01D 15/38(2006.01)

权利要求书2页 说明书7页 附图3页权利要求书2页 说明书7页 附图3页

(54)发明名称

一种亲和层析介质、制备方法及其用途(57)摘要

本发明公开了一种在基质为亲水改性聚丙烯酸酯类或其共聚物材料上制备亲和层析介质的方法及由此方法制得具有高通量层析性能的产品。制备方法包括：（1）用氧化剂在酸性条件下进行选择性氧化，将材料表面的羟基氧化为醛基；（2）通过氨基与醛基生成席夫碱的反应将亲和配基化学偶联于介质表面，制得亲和层析介质。由此方法得到的产品的特征在于产品基质为超大孔聚丙烯酸酯类材料，此基质的表面已经化学偶联了亲水性多糖分子，在此亲水性表面上进一步衍生得到了此种亲和介质产品。本发明提供的方法，操作简便、反应条件温和，得到的亲和层析介质稳定，通透性高，配基偶联量高，对抗体选择性高，在生物技术尤其是生化分离领域有很大的应用前景。

CN 103586008 ACN 103586008 A

权 利 要 求 书

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1.一种亲和层析介质，其特征在于，其以表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球为基质，该基质具有孔径分布范围为200～500nm的孔道，且表面偶联有亲水性的多糖分子，含氨基的亲和配基通过醛基与基质进行偶联。

2.如权利要求1所述的层析介质，其特征在于，所述基质为表面亲水化的超大孔甲基丙烯酸缩水甘油醚与二乙烯基苯共聚物微球；

优选地，所述多糖选自琼脂糖、葡聚糖或蔗糖中的任意一种或者至少两种的混合物。3.如权利要求1或2所述的层析介质，其特征在于，所述亲和配基的分子量为104～107Da；

优选地，所述亲和配基选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Protein G、Protein A、乙肝表面抗原、破伤风疫苗或狂犬疫苗抗原中任意一种或者至少两种的组合。

4.如权利要求1-3之一所述的层析介质，其特征在于，所述层析介质操作流速为0～3200cm/h，耐受压力为0～20MPa；

优选地，所述层析介质在流速10～1600cm/h流速范围内，结合目标物动态载量变化20%。

5.一种如权利要求1-4之一所述的亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）选择性氧化：将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球表面的羟基选择性氧化为醛基，得到氧化后的微球；

（2）偶联亲和配基：将亲和配基通过共价键化学键合到氧化后的微球表面。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述选择性氧化过程如下：将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球置于酸性溶液中，然后加入氧化剂，控制反应温度为30～60℃，反应2～12h后，得到氧化后的微球。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述酸性溶液的pH值为2～5；优选地，步骤（1）中所述酸性溶液的pH调节所用酸选自盐酸、硫酸或醋酸中的任意一种或者至少两种的混合物；

优选地，步骤（1）所述氧化剂选自高锰酸钾、高碘酸、高碘酸钾或次氯酸钠中的任意一种或者至少两种的混合物；

优选地，步骤（1）所述氧化剂的浓度为10～30mg/mL酸性溶液，优选13～27mg/mL酸性溶液；

优选地，步骤（1）所述酸性溶液的体积用量为被氧化的微球质量的10～20倍；优选地，步骤（1）所述反应温度为35～55℃，优选38～52℃；优选地，步骤（1）所述反应时间为2～10h，优选3～9h。8.如权利要求5-7之一所述的方法，其特征在于，步骤（2）中偶联亲和配基的过程为：将步骤（1）得到的氧化后的微球放入反应釜中，加入含亲和配基的缓冲溶液，调节pH值3.0～8.0进行偶联反应，控制反应温度20～40℃，保持反应24～72h，得到表面偶联亲和配基的亲和层析介质。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述缓冲溶液种类选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠体系、Tris-HCl体系或乙酸-乙酸钠体系中的任意一种或者至少两种的组合；

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CN 103586008 A

权 利 要 求 书

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优选地，步骤（2）中所述亲和配基的浓度为0.5～20mg/mL缓冲溶液，优选1～18mg/mL缓冲溶液；

优选地，所述缓冲溶液体积用量与氧化后的微球的质量比是5:1～20:1；优选地，步骤（2）中所述反应温度为室温；优选地，步骤（2）中所述反应时间为25～70h，优选30～65h；优选地，步骤（2）调节pH值为3.5～7.5，优选3.7～7.2。10.一种如权利要求1-4之一所述的亲和层析介质的用途，其特征在于，所述亲和层析介质用于纯化各类抗体、疫苗等生物大分子。

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说 明 书

一种亲和层析介质、制备方法及其用途

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技术领域

本发明涉及聚合物层析介质制备及应用领域，尤其涉及一种以聚合物材料为基质

的亲和层析介质的产品及其制备方法，以及产品在生化色谱分离方面的应用，特别指以超大孔聚丙烯酸酯类材料为基质的亲和介质产品的制备及其应用。

[0001]

背景技术

[0002] 亲和层析是通过介质上的配基与目标分子之间的特异性吸附和解离来实现纯化目标分子的目的。由于这种特异性的作用力，亲和层析具有高度选择性、高活性回收等特点，对分离含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效，成为生物制药领域中分离纯化生物活性物质的一种重要方法。

[0003] 随着当前生物医药技术的快速发展，对疫苗、抗体类药物的需求与日俱增，因此，如何快速高效地得到纯度较高的疫苗、抗体分子是一项一直追求的目标。目前商品化亲和层析介质多以琼脂糖为基质，由于其为多糖基质，质地较软、孔径小，故机械强度差，难以提高流速，因此成为实现快速、高效分离纯化的瓶颈。[0004] 聚合物微球作为生化分离介质，其优点在于机械强度高、化学性质稳定、耐受pH范围宽，能够在高压下操作等。另外，为了改善微球表面性能，提高其亲水性，本申请的在先申请已经将微球表面化学镀层了一层亲水性多糖分子（CN201210091582.X），充分抑制了蛋白等生物大分子在介质表面的非特异性吸附，修饰后的微球仍能保持较好的通透性。[0005] 迄今为止，未见报道在多糖亲水化PGMA-DVB超大孔微球表面，氧化成醛后偶联亲和配基的方法，以及该方法制备的高流速的亲和层析介质。发明内容

[0006] 本发明的目的之一在于提供一种能够满足快速、高效层析过程的亲和层析介质，所述层析介质克服了多糖基质孔径小、机械强度差和流速低的问题。[0007] 为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：[0008] 一种亲和层析介质，其以表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球为基质，该基质具有孔径分布范围为200～500nm的孔道，且表面偶联有亲水性的多糖分子，含氨基的亲和配基通过醛基与基质进行偶联。[0009] 所述超大孔意指孔径为200～500nm。

[0010] 本申请所述基质可由本申请人的在先申请CN102617869A公开的方法制备得到。[0011] 该亲和层析介质偶联配基后，介质仍能保持良好的通透性。

[0012] 所述表面亲水化的具有超大孔结构的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球具有大孔贯穿结构，适合大分子快速传质，可以有效提高分离速度。[0013] 优选地，所述基质为表面亲水化的超大孔甲基丙烯酸缩水甘油醚与二乙烯基苯共聚物微球（PGMA-DVB）。[0014] 优选地，所述多糖选自琼脂糖、葡聚糖或蔗糖中的任意一种或者至少两种的混合

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CN 103586008 A

说 明 书

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物。

本发明选择表面亲水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物作为基质，优选表面亲

水化的超大孔聚丙烯酸酯类或其共聚物微球，基质表面偶联了亲水性的多糖分子，在使微球表面具有亲水性的同时表面还具有大量的可进一步衍生的羟基，本发明正是利用微球表面的羟基氧化成醛，然后利用醛基偶联大分子亲和配基，最后制得对抗体等生物大分子有特异选择性的亲和层析介质。

[0016] 与传统的多糖基质的亲和层析介质相比，该介质具有百纳米级的贯通孔，可以对大尺寸生物分子有很好的传质特性，偶联亲和配基后，可以实现快速、高效和高通量的亲和层析过程。

[0017] 该亲和层析介质为多孔结构，平均孔径覆盖范围为20～500nm，粒径范围15～200μm，耐受压力范围0～20MPa，表面化学偶联大分子亲和配基分子量范围10-10000kDa。[0018] 所述基质表面能够偶联大尺寸分子亲和配基，所述亲和配基的分子量范围104～107Da，偶联配基后仍能保持高的通透性，操作流速可覆盖0～3200cm/h，耐受压力范围为0～20MPa。

[0019] 所述亲和层析介质能够在高流速下继续保持高载量，在流速10～1600cm/h流速范围内，结合目标物动态载量变化20%。[0020] 所述亲和配基选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Protein G、Protein A、乙肝表面抗原、破伤风疫苗或狂犬疫苗抗原中任意一种或者至少两种的组合。偶联亲和配基后的亲和层析介质主要针对各种抗体分子有特异性结合，用于纯化各类抗体及疫苗等生物大分子。

[0021] 本发明的目的之二在于提供一种如上所述的亲和层析介质的制备方法，所述方法包括如下步骤：[0022] （1）选择性氧化：将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球表面的羟基选择性氧化为醛基，得到氧化后的微球；[0023] （2）偶联亲和配基：将亲和配基通过共价键化学键合到氧化后的微球表面。[0024] 表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球，包括表面亲水镀层琼脂糖、葡聚糖、蔗糖等糖类的亲水化微球。

[0025] 传统多糖基质的介质表面偶联蛋白大分子的方法多为环氧活化、溴化氰活化和戊二醛活化法等方法，本发明中所采用的氧化法将介质表面的羟基选择性氧化成醛，然后将带有氨基的亲和配基分子偶联至介质表面。[0026] 作为优选技术方案，步骤（1）中所述选择性氧化过程如下：将表面亲水化的聚丙烯酸酯类或其共聚物微球置于酸性溶液中，然后加入氧化剂，控制反应温度为30～60℃，反应2～12h后，得到醛基密度可控的活化中间物即氧化后的微球。[0027] 所述酸性溶液的pH值为2～5，例如2.2、2.5、2.8、3.1、3.4、3.7、4、4.3、4.6或4.9。

[0028] 作为优选技术方案，步骤（1）中所述酸性溶液的pH调节所用酸可以选择盐酸、硫酸或醋酸中的任意一种或者至少两种的混合物。[0029] 所述氧化剂可以为高锰酸钾、高碘酸、高碘酸钾或次氯酸钠中的任意一种或者至少两种的混合物。

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说 明 书

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优选地，所述氧化剂的浓度为10～30mg/mL酸性溶液，即，每ml酸性溶液中含有

10～30mg的氧化剂，优选13～27mg/mL酸性溶液。

[0031] 所述酸性溶液的体积用量为被氧化的微球质量的10～20倍。即微球质量:溶剂体积（酸性溶液体积）=1:10～20（g/mL）。[0032] 所述反应温度例如为33℃、36℃、39℃、42℃、45℃、48℃、51℃、54℃、57℃或59℃，优选35～55℃，进一步优选38～52℃。[0033] 所述反应时间例如为2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h或11.5h，优选2～10h，进一步优选3～9h。[0034] 作为优选技术方案，步骤（2）中偶联亲和配基的过程为：将步骤（1）得到的氧化后的微球放入反应釜中，加入含亲和配基的缓冲溶液，调节pH值3.0～8.0进行偶联反应，控制反应温度20～40℃，保持反应24～72h，得到表面偶联亲和配基的亲和层析介质。通过氨基与醛基生成席夫碱的反应将亲和配基化学偶联于介质表面，制得亲和层析介质。[0035] 作为优选技术方案，步骤（2）中所述缓冲溶液种类可以为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠体系、Tris-HCl体系或乙酸-乙酸钠体系中的任意一种或者至少两种的组合。[0036] 作为优选技术方案，步骤（2）中所述的亲和配基的浓度为0.5～20mg/mL缓冲溶液，即每ml缓冲溶液中含有亲和配基0.5～20mg，优选1～18mg/mL缓冲溶液。[0037] 缓冲溶液体积用量与氧化后的微球的质量比是5:1～20:1（mL/g）。[0038] 优选地，步骤（2）中所述反应温度例如为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃或38℃，优选步骤（2）中所述反应温度为室温（25℃）。[0039] 优选地，步骤（2）中所述反应时间例如为27h、31h、35h、39h、43h、47h、51h、55h、59h、63h、67h或71h，优选控制反应时间为25～70h，进一步优选30～65h。[0040] 优选地，步骤（2）调节pH值例如为3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.1、6.4、6.7、7、7.3、7.6或7.9，优选3.5～7.5，进一步优选3.7～7.2。[0041] 优选地，所述亲和配基包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、Protein G、Protein A、乙肝表面抗原、破伤风疫苗或狂犬疫苗抗原中的任意一种或者至少两种的组合。[0042] 所述基质表面能够偶联大尺寸分子亲和配基，所述亲和配基的分子量范围104～107Da。

[0043] 采用上述方法偶联protein A，为检验偶联Protein A后亲和介质的性能，将介质填入不锈钢色谱柱管中，柱管规格为

将装填好的色谱柱连接于高效液相色

谱上测试微球对人抗体IgG的选择性，吸附载量，并以人血清为实际测试样品。[0044] 与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0045] 在表面亲水化后的超大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油醚类材料表面能够均匀的偶联大分子配基，该产品由于具有超大孔结构，能够使大尺寸亲和配基如疫苗等扩散至材料内部，偶联配基后的介质产品，仍能保持较好的通透性，能够应用于快速高效分离纯化抗体。[0046] 本发明所述的方法，能够应用于大多数表面用多糖亲水化的疏水材料的表面，尤其是超大孔聚合物微球，偶联配基后的聚合物微球能够应用于生物技术和色谱分离领域。而且，所述方法操作简便、反应条件温和，得到的亲和层析介质稳定，通透性高，配基偶联量高，对抗体选择性高，在生物技术尤其是生化分离领域有很大的应用前景。

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说 明 书

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附图说明

图1为偶联配基前微球和实施例3所得偶联亲和配基proteinA后的聚合物微球

的电子扫描显微镜图片，A1和A2为偶联前微球；B1和B2为偶联后微球；[0048] 图2为实施例8所得的亲和介质与偶联配基前的压降对比；[0049] 图3为实施例8所得的亲和介质与偶联配基前的孔径分布对比；

[0050] 图4为实施例6所得的亲和介质在亲和层析模式下对人血清中IgG的分离纯化图；

[0051] 图5为实施例6所得亲和介质纯化人血清中的IgG的凝胶电泳图。

[0047]

具体实施方式

[0052] 下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明所得到的介质产品不仅局限于实施例中的产品，适合所有与抗体有亲和作用的带有氨基的大分子配基。

[0053] 实施例1[0054] 1）琼脂糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高锰酸钾氧化

[0055] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=2.0的浓度为10mg/mL的KMnO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡2h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0056] 2）氧化后的微球表面偶联牛血清白蛋白（BSA）[0057] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入5mL pH=7.0的BSA浓度为10mg/mL的磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应48h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余BSA浓度，计算配基BSA的偶联量为20mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0058] 实施例2[0059] 1）琼脂糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸钾氧化

[0060] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为30mg/mL的KIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡12h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0061] 2）氧化后的微球表面偶联Protein G[0062] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入5mL pH=5.0的Protein G浓度为10mg/mL的HAc-NaAc缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应48h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余Protein G浓度，计算配基Protein G的偶联量为20mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0063] 实施例3[00] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸钾氧化

[0065] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=5.0的浓度为10mg/mL的KIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0066] 2）氧化后的微球表面偶联人血清白蛋白（HAS）

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CN 103586008 A[0067]

说 明 书

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将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入5mL pH=8.0的HSA浓度为

15mg/mL的磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应24h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余HSA浓度，计算配基HSA的偶联量为22mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0068] 实施例4[0069] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0070] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为10mg/mL的HIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0071] 2）氧化后的微球表面偶联Protein A[0072] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入20mL pH=3.0的Protein A浓度为0.5mg/mL的乙酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应24h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余Protein A浓度，计算配基Protein A的偶联量为8mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0073] 实施例5[0074] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0075] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入20mL pH=3.0的浓度为30mg/mL的HIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中55℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0076] 2）氧化后的微球表面偶联Protein A[0077] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入5mL pH=3.0的Protein A浓度为20mg/mL的磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，40℃反应24h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余Protein A浓度，计算配基Protein A的偶联量为30mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0078] 实施例6[0079] 1）蔗糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0080] 准确称取琼脂糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为10mg/mL的KIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中35℃下振荡12h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0081] 2）氧化后的微球表面偶联Protein A[0082] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入5mL pH=8.0的Protein A浓度为10mg/mL的磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，20℃反应72h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余Protein A浓度，计算配基ProteinA的偶联量为35mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液中性。[0083] 实施例7[0084] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0085] 准确称取葡聚糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为10mg/mL的HIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。

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CN 103586008 A[0086]

说 明 书

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2）氧化后的微球表面偶联乙肝表面抗原（HBsAg）

[0087] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入10mL pH=7.0的浓度为0.5mg/mL的HBsAg磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应24h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余HBsAg浓度，计算配基HBsAg的偶联量为2.3mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液在280nm下无紫外吸收。[0088] 实施例8[00] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0090] 准确称取葡聚糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为10mg/mL的HIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0091] 2）氧化后的微球表面偶联破伤风疫苗配基[0092] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入20mL pH=7.0的浓度为1mg/mL的破伤风疫苗磷酸缓冲溶液，120rpm机械搅拌下，室温反应24h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余破伤风疫苗配基浓度，计算的偶联量为8mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液在280nm下无紫外吸收。实施例9[0094] 1）葡聚糖亲水化超大孔PGMA-DVB微球用高碘酸氧化

[0095] 准确称取葡聚糖亲水化PGMA-DVB微球1.0g放入50mL的锥形瓶中，然后加入10mL pH=3.0的浓度为10mg/mL的HIO4-HCl溶液，120rpm振荡摇床中30℃下振荡6h后，进行抽滤，并用去离子水进行洗涤，洗涤后抽滤至微球表面无明显水份。[0096] 2）氧化后的微球表面偶联狂犬疫苗配基[0097] 将步骤1）制得的微球放入反应釜中，然后向其中加入20mL pH=7.0的浓度为1mg/mL的狂犬疫苗磷酸缓冲溶液，60rpm机械搅拌下，室温反应48h，反应结束后，离心取上清测定溶液中剩余狂犬疫苗疫苗配基浓度，计算的偶联量为2mg/g干燥微球。用G4砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至洗涤液在280nm下无紫外吸收。[0098] 制得的亲和介质的通透性、抗体动态载量、色谱分离测定[0099] 实施例10亲和介质通透性测定[0100] 1）填装偶联配基后的微球[0101] 将1.0g改性后（前）微球放于20mL20%乙醇水溶液中，超声分散30min后，放于装柱机的匀浆器中，以10MPa压力装柱，持续时间1h，柱管规格为φ4.6×50 mm。[0102] 2）在实施例10中，步骤1）所装填的色谱柱连接于液相色谱仪上，以pH=7.0，50 mM 磷酸缓冲液为流动相，测试不同流速下色谱柱的压降，如图2所示，为填装实施例8的偶联HBsAg配基后的介质与偶联前的对比压降图，从图上可以看出该亲和介质产品的压降比偶联前略有增高，但仍能在高操作流速下进行使用。为了进一步印证该产品在偶联前后通透性变化，将偶联前后的实施例8的产品用压汞法对孔径分布进行了测定，如图3所示，偶联配基后产品的孔径分布无明显变化，依然保持大孔结构保证了良好的通透性。

[0093]

实施例11抗体动态载量测定

[0104] 以人抗体IgG测定介质的动态载量[0105] a 采用实施例10中步骤1）所述的装填方法，将实施例6的产品装填于色谱柱中，

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说 明 书

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色谱条件如下：样品浓度2 mg/mL 的IgG磷酸缓冲溶液（pH=7.0，50mM 磷酸缓冲液）；A泵头进样方式，流速 1 mL/min；流动相B为 pH=3.0的甘氨酸-HCl缓冲液溶液，样品和流动相用于以下各色谱测试步骤：[0106] 1）测试系统死体积

[0107] a.用pH=3.0的甘氨酸-HCl缓冲液溶液配制2.0 mg/mL 的IgG溶液；b.连接色谱柱到液相系统中，以泵头进样方式用a步骤中所配溶液，记录开始穿透时间t0，测试系统死体积V0，并得到样品的最大紫外吸收值A0。[0108] 2）测试IgG动态载量

[0109] a. 以泵头进样方式用2 mg/mL 的IgG 溶液50 mL（pH=7.0，50 mM的磷酸缓冲液）记录5%穿透时间t5%。b. 计算IgG的动态吸附量，公式如下：

[0110]

（F，测试流速，mL/min；C，IgG样品浓度，mg/mL；V，介质体积，

mL。）

[0111]

以上实施例1-10所制得的亲水改性微球，测试IgG动态吸附量，均用上述测试方

法。

实施例12亲和色谱模式对人血清中的IgG进行分离纯化

[0113] 将实施例6制得的介质按照实施例10中步骤1）中方法装填成色谱柱（φ4.6×50mm）；

[0114] 在实施例12中，步骤1）所装填的色谱柱连接于液相色谱仪上，色谱条件如下：样品浓度2mg/mL的人血清溶液（pH=7.0，50mM的磷酸缓冲液）；上样量5mL；流速1mL/min；流动相A pH=7.0，50mM的磷酸缓冲液；B pH=3.0甘氨酸-HCl缓冲液。色谱条件：A相上样待流穿峰降至基线，B相开始洗脱并接收洗脱峰记录下接收体积，接收液用凝胶电泳进行测定其纯度。

[0115] 其分离色谱图见图4，峰1为杂蛋白穿透峰、峰2为IgG洗脱峰。其凝胶电泳测试图见图5，IgG在5W标记处有明显条带，为其重链片段，且无其他明显杂带，表明纯化所得抗体纯度较高。

[0116] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

[0112]

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说 明 书 附 图

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图1

图2

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说 明 书 附 图

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图3

图4

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说 明 书 附 图

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图5

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