调查 研究实时荧光定量PCR定量检测肉制品中牛/羊/猪源性成分 刘敏 黄小凯 胡秀红 温州市质量技术监督检测院
肉类源性成分鉴定的方法多种多样，国内外在基因水平上对肉类源性成分进行鉴定的方法也越来越多。但是定性方法只能证明样品中含有某种源性的肉类而不能证明不含有其他种类的肉类。而且对于肉类掺杂的比例的确定，在标准上还是一片空白。因此，建立一个方法去甄别肉类食品的轻微污染与故意掺假显得十分重要。本文主要对实时荧光定量ＰＣＲ定量检测肉制品中牛／羊／猪源性成分的方法进行研究。试验部分试剂耗材。ＤＮＡ提取试剂盒。Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭＩＸ。ＤＮＡ标准品。ＤＮＡ引物和探针。仪器设备。实时荧光定量ＰＣＲ仪。 样品DNA提取。通过从提取效果、提取时间、提取成本等各个方面考虑，最终选择了试剂盒法。标准曲线。动物源性和牛／羊／猪源性：每个ｒｕｎ设置标准曲线５个反应、阴性控制１个反应、阳性控制２个反应，每个样本ＤＮＡ至少２个反应。ＤＮＡ标准品的起始拷贝数为１，０００，０００，通过用Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢ进行稀释，稀释至浓度分别为１００，０００、１０，０００、１，０００、１００、１０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ。每个校正点用２μｌ的标准ＤＮＡ。将每个反应的拷贝数量都记录在实时荧光定量ＰＣＲ仪的分析软件中，根据检测到的荧光得到Ｃｔ值，从而得出标准曲线。PCR体系。ＰＣＲ扩增体系中包含Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭＩＸ １２μＬ，模板ＤＮＡ２μＬ，上下游引物２μＬ，探针 １μＬ，加水至２５μＬ。在该体系下，ＰＣＲ扩增曲线明显，能达到定量的要求。PCR程序。本实验室采用罗氏ＬＣ９６，以下所列的ＰＣＲ程序效果比较好。预变性９０ｓ ，９５℃，变性５ｓｅｃ， ９５℃，退火１０ｓｅｃ， ６２℃，延伸１５ｓｅｃ， ６５℃，循环数为４５。荧光通道的选择ＦＡＭ，在延伸阶段收集荧光。实验获得结果进行数据分析，三种化合物在２０￣２０００００拷贝数范围内线性关系良好，相关系数均大于０．９７。其中各种源性线性如下：牛源性ｙ ＝ －３．２１６ｘ＋４１．０８猪源性ｙ＝－３．１４０ｘ＋３９．５２羊源性ｙ＝－２．５９０ｘ＋３７．４１动物源性ｙ ＝ －３．３１２ｘ＋４０．４９注：其中ｘ＝ｌｏｇＺ，Ｚ为模板ＤＮＡ的起始拷贝数。结果计算。根据标准曲线可以求得样品中牛／羊／猪和动物源性基因的起始拷贝数，样品中牛／羊／猪占动物源性基因含量按式（１）进行计算ｗ＝Ｚ１／Ｚ２ ＊１００％ ＊ｋ………………（１）ｗ——样品中牛／羊／猪占动物源性基因含量（％）；Ｚ１——牛／羊／猪基因起始拷贝数（ｃｏｐｉｅｓ）；Ｚ２——动物基因起始拷贝数（ｃｏｐｉｅｓ）；ｋ——校正因子，ｋ值为实际阳性控制ＤＮＡ百分值／计算所得ＤＮＡ百分值，１００％／ｗ。检出限、精密度和回收率。２０和２００，０００起始拷贝数的标准物质的扩增曲线明显，阴性对照无明显扩增曲线，仪器的检出限可以达到０．０１％。结合实际样品及ＤＮＡ提取等因素，本方法的检出限可以达到１％。按照重量配比，在不含目标源性混合肉中分别掺入１％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）和５０％（ｗ／ｗ）的目标源性肉类，再取一个纯肉样品，分别进行６个平行的测定，获得６个平行的实测数值。通过计算检出限为１％，精密度小于１０％和回收率在８５％－１１０％之间。本方法建立了牛／羊／猪源性成分的定量曲线，实现了肉制品中牛／羊／猪源性的相对定量，通过优化实验步骤和方法，使得检测时间短、精度较高、稳定性较好。该方法也为制定相关检测方法标准提供参考。基金项目：温州市科技局立项项目（基金编号为S20150025）结果与讨论线性范围、线性方程、相关系数。通过66·FOOD INDUSTRY
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