pLKO.1载体
pLKO.1载体
美国RNAi协作组（The RNAi Consortium）已经利⽤pLKO.1载体⾻架构建了针对15,000个⼈类基因和15,000⼩⿏基因的shRNA库，详细信息见⽂献Moffat etal., Cell 2006 Mar; 124(6): 1283-98。pLKO.1是⼀种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导⼊细胞，作为常规RNAi载体使⽤，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。⼀旦进⼊细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin抗性，Puromycin筛选可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。图 2，3分别为pLKO.1载体的图谱和shRNA的⽰意图。
元件5’ LTRRREU6shRNA insert
cPPThPGKPuro Rsin 3’ LTRF1 oriAmp RpUC ori
注释
5’ 长末端重复序列（long terminal repeat）
Rev反应元件，介导转录本出核，从⽽被有效包装⼈类U6启动⼦，RNA聚合酶Ⅲ可以识别，指导下游shRNA转录⼩发卡RNA插⼊⽚断
Central polypurine tract，促进载体⽚断⼊核，提⾼整合效率
⼈类磷酸⽢油激酶启动⼦，指导puromycin抗性基因的组成性表达表达的蛋⽩使细胞具有puromycin抗性，⽅便选择3’ 失活长末端重复序列f1细菌复制起点
氨苄青霉素抗性基因pUC细菌复制起点
siRNA序列克隆⼊pLKO.1载体
四. siRNA序列克隆⼊pLKO.1载体
酶切pLKO.1克隆载体，合成的正向和反向寡核苷酸退⽕以后形成寡核苷酸双链，两端具有和酶切后的载体兼容的粘性末端，经过连接反应，便能产⽣含有shRNA序列的pLKO.1载体。A. 实验材料
AgeI (NEB, #R0552S)，EcoRI (NEB, #R0101S)，Buffer 2(NEB, #B7002S)，Solution I (Takara, D6022)，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（QIAGEN，#28704），1.5ml微型离⼼管（Biologix, 货号：80-1500）。B. 寡核苷酸退⽕
溶解合成的寡核苷酸，终浓度20µM（⾼压灭菌⽔溶解核酸，⽔的体积=（合成得到的核酸nmol数X50）µl），按照表2反应体系在1.5ml微型离⼼管内配制反应。在1L烧杯内准备700-800ml温度为95oC-100oC的⽔，将微型离⼼管置⼊烧杯，放置于试验台上，缓慢降温⾄室温，这个过程约需要2⼩时。表2：退⽕反应体系
5µl5µl5µl35µl
C. 酶切pLKO.1克隆载体
1. ⾸先⽤AgeI酶切，反应体系如下：
4µg5µlpLKO.1克隆载体10 X NEB buffer 1Forward oligoReverse oligo10 x NEB Buffer 2H2O2µlAgeI补⽔⾄总体积50µl
37oC⽔浴孵育1⼩时。
2. ⽤琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切反应产物，30µl H2O洗脱。3. 纯化产物⽤EcoRI酶切，反应体系如下：
30 µl
AgeI酶切产物
5µl2µl13 µl
10 X NEB buffer for EcoRIEcoRIH2O
37oC⽔浴孵育1⼩时。
4. 在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离酶切后载体，可看到⼀约7kb的⽚断（AgeI和EcoRI酶切会切出约60bp的寡核苷酸，在0.8%的凝胶上⽆法看到），切胶，回收，30µl H2O洗脱。5. 测量核酸浓度。D. 连接和转化
按照下述反应体系配制连接反应：2µl1µl 20ng/ µl
2µl
5µl退⽕的寡核苷酸双链（步骤四. B）酶切的pLKO.1克隆载体H2Osolution I22oC孵育15分钟，然后进⾏转化：取5 µl连接产物加⼊50 µl感受态细胞内，冰上放置30分钟，42oC⽔浴90秒，速置于冰上2分钟，将感受态细胞涂布于氨苄平板上。16⼩时后可见有⽩⾊克隆。同时，如果第⼀次使⽤酶切载体，推荐进⾏⼀个对照连接反应，不加寡核苷酸双链，⽤⽔补齐体积，酶切良好的载体为对照连接反应没有克隆或1-2个克隆，⽽加⼊寡核苷酸的连接反应可以得到10个以上的克隆。E. 阳性克隆的鉴定
挑取3-5个克隆，提取质粒，通过酶切和测序来鉴定阳性克隆。1. 酶切鉴定
1 µg2 µl
质粒10 X NEB buffer for EcoRI0.8 µlEcoRI0.8 µlNcoI补⽔⾄总体积20µl
37oC⽔浴孵育1-2个⼩时。电泳可以见到2kb和5kb的两个⽚断。2. 测序鉴定
有时因为碱基修饰的原因，质粒不能被切开，这时可以通过直截测定序列的⽅法来鉴定。酶切鉴定得到阳性克隆后，进⼀步需通过测序的⽅法来证实寡核苷酸序列是否正确。测序引物为5’ CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA 3’。
五. 制备病毒颗粒
进⾏这些实验的实验室必须具有操作HIV和HIV相关病毒的资质和经验。
pLKO.1载体可以被作为常规载体使⽤，通过转染操作导⼊细胞，瞬时敲低基因。如果希望得到稳定敲低基因的细胞系，则需要⽤pLKO.1载体包装成病毒颗粒，然后感染（infect）细胞，⽤puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞。
下⾯以转染60mm培养⽫为例进⾏说明，如果需要更⼤量的病毒液，可以按⽐例扩⼤规模。第⼀天：
种植细胞，在60mm培养⽫内种植7x105的HEK-293T细胞，培养基体积为4ml。第⼆天：
转染，在细胞种植16-24⼩时后进⾏转染操作，可以按照所在实验室常规转染293T的⽅法进⾏转染，也可选⽤前景科创公司的293Fect（专业转染293细胞的转染试剂），⽅便快速。下⾯转染操作以293Fect为例说明：
第三天：
细胞过夜培养后，换⽤新鲜培养基（旧的培养基需要经过10%漂⽩剂处理后才能丢弃）。24⼩时后，观察293T细胞，如果细胞状态不好，约有20%-30%的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产⽣），置于15ml离⼼管内（Biologix, 货号：10-0151），存放于4oC。否则，可继续等待直⾄48⼩时，待细胞状态如上⾯描述时，收获培养基。第四天：
收获⼀次慢病毒后，可继续加⼊4ml 新鲜培养基，24⼩时后再收获⼀次病毒。将两次收获的病毒液合并，1250rpm，离⼼5分钟，将细胞碎屑离⼼⾄管底，取上清感染细胞或者冻存。
