２０１４年７月第１３卷第７期 Ｊｕｌｙ ２０１４ Ｖｏ１．１３ Ｎｏ．７ 今日健康 ＪＩＮＲＩ ＪＩＡＮＫＡＮＧ ・３３３・ 垂体腺瘤ｐ１ ６抑癌基因免疫组化和原位杂交的检测及与ＰＣＮＡ 共表达的研究 吴丽佳 （齐齐哈尔市北钢集团公司职工医院，黑龙江齐齐哈尔，１６１０４１） 【摘要】 目的研究良性肿瘤垂体腺瘤中ｐ１６抑癌基因的改变和可能的作用机制。方法用免疫组化和原位杂交技术研究ｐ１６ 在垂体腺瘤中的表达及其与临床病理的关系；并结合反映细胞增殖活性的指标ＰＣＮＡ的改变，以进一步了解ｐ１６在垂体腺瘤发生、发 展过程中可能作用的分子机理。结果ｐ１６基因在垂体腺瘤中不发生缺失，而是存在不同程度的表达增强，其免疫组化阳性百分率的 高低与肿瘤的大小、侵袭性、复发密切相关；ｐ１６的表达与ＰＣＮＡ呈高度正相关。结论ｐ１６、ＰＣＮＡ反映垂体腺瘤细胞的增殖活性，可 能对临床预后有提示意义。 【关键词】 垂体腺瘤ｐ１６ ＰＣＮＡ免疫组化原位杂交 【中图分类号】 Ｋ４４６．８ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】 １６７１—５１６０（２０１￣０７—０３３３—０１ 棕色。见图１（略）尸检正常垂体切片中，所有垂体前叶内分泌细胞和间质 细胞都呈ｐ１６组化阴性。表明ｐ１６蛋白在肿瘤细胞中含量常常比正常细 胞高。 ２．２ ｐ１６与ＰＣＮＡ相关性的分析 抑癌基因ｐ１６定位于染色体９ｐ２１，其编码的蛋白为细胞周期蛋白依 赖激酶４（ＣＤＫ４）蛋白的抑制因子，参与细胞周期的。ｐ１６基因在多种 肿瘤中的变化及其规律是抑癌基因研究的关注热点。一方面ｐ１６变化的 分子机制已被揭示有基因的缺失、突变、甲基化等，另一方面以原发肿瘤 临床标本为材料的大量工作证明ｐ１６改变所涉及的肿瘤种类相当广泛。 用统计学上等极相关分析方法，对每例标本的ｐ１６阳性细胞百分率 和相应的ＰＣＮＡ阳性细胞百分率，进行相关性分析，得校正Ｓｐｅａｒｍａｎ等 级相关系数Ｉ＇Ｓ’＝０．８５２，Ｐ＜０．０１，表明ｐ１６与ＰＣＮＡ的表达呈高度正相关， 见图２。ｆ略） ２．３ ｐ１６原位杂交 １材料和方法 １．１材料 １ １例垂体腺瘤均为上海第二医科大学附属瑞金和仁济医院新鲜垂 体肿瘤切除手术标本。组织学分型为嗜酸、嗜碱、嫌色、混合性细胞腺瘤 和组织增生。所有用于免疫组化和原位杂交的病理组织标本均经统一的 方法进行处理，包括：４％多聚甲醛一ＰＢＳ固定４～５小时后，梯度乙醇脱 水，石蜡包埋，切片厚６ ｉ＇Ｉ１，每例标本均做ＨＥ染色。 １．２方法 １．ｐ１６和ＰＣＮＡ免疫组化 １１例石蜡包埋的切片中所有肿瘤细胞和间质细胞的胞浆部位均出 现蓝色杂交信号，见图３（略）。阴性对照片所有细胞均不着色。表明，垂体 腺瘤细胞和间质细胞均有ｐ１６基因ｍＲＮＡ存在。 ３讨论 在本实验ｐ１６免疫组化结果中，垂体腺瘤细胞一部分呈反应阳性， 部分阴性，而同一标本中的非肿瘤细胞的间质细胞则绝大多数为阴 性，仅有少部分为阳性，且很弱。这一现象表明，组化阳性的肿瘤细胞其 ～ｐ１６免疫组化采用Ｄａｋｏ公司ＬＳＡＢ试剂盒。实验步骤包括：病理组 织经前述统一方法制备后，切片经脱蜡复水，Ｔｒｉｔｏｎ一１００处理，血清白蛋 白封闭，抗ｐ１６多克隆抗体（ｃ一２０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）ｌ：６０稀释，４℃温育过夜。 生物素化连结抗体原液室温温育２０ ａｒｉｎ，辣根过氧化物酶联结的链霉亲 和素１：８０稀释，室温２０ ｒａｉｎ，ＤＡＢ（３，３一二氨基联苯胺，辣根过氧化物 酶催化底物）暗环境中显色至合适时终止反应。。操作包括：石蜡切片经脱 ｐ１６含量要比非肿瘤细胞的高。据此，本文把组化阳性的肿瘤细胞定为存 在ｐ１６蛋白的过度表达。而各个病例ｐ１６阳性细胞百分率的高低，正是 反映了该例肿瘤细胞ｐ１６基因过表达的程度。本实验原位杂交的结果显 示间质细胞和肿瘤细胞中均存在ｐ１６的ｍＲＮＡ，表明ｐ１６基因在垂体腺 蜡复水后，３％Ｈ２０２一甲醇处理，血清白蛋白封闭，抗ＰＣＮＡ单抗 （ＩＤＭ８７９，华美生物工程公司）１：１００稀释，４。Ｃ温育过夜，生物素化鼠抗 ｌ：５０稀释，室温温育４５ｍｉｎ，过氧化物酶联结的亲和素１：５０稀释，室 瘤中没有缺失，那些组化阴性的细胞所含的ｐ１６蛋白含量较低。 ｐ１６的过表达可能与细胞的增殖活性有关，主要鉴于：（１）免疫组化阳 性细胞多为那些体积较大、细胞核较大、核浆比例较大的肿瘤细胞，反映 了这些细胞可能具有较强的增殖活性，而绝大多数间质细胞和部分肿瘤 细胞呈阴性反应；（２）ｐ１６与ＰＣＮＡ的表达呈高度正相关，ＰＣＮＡ是一个分 温温育４５ ｍｉｎ，暗环境下ＤＡＢ显色合适后终止反应。 ２．ｐ１６原位杂交 病理组织经前述方法统一制备，其中捞片和梯度酒精复水均用焦碳 酸二乙酯（ＤＥＰＣ）处理过的双蒸水。杂交前主要实验步骤为：Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣ１，蛋白酶Ｋ（２０ ｓ／ｍｌ ８ｒａｉｎ，３７ ｃＣ），１％多聚甲醛一ＰＢＳ，０．１ ｍｏｌ／Ｌ甘氨 酸和Ｏ．２５％乙酸酐一Ｏ．１ ｍｏｌ／Ｌ三乙醇胺，然后２×ＳＳＣ（标准柠檬酸钠溶 液）漂洗，切片在５５℃杂交过夜。杂交探针为ｐ１６ ＲＮＡ探针（ＺＤＰ７０１７， Ｏ．８ ｋｈ地高辛标记。杂交后组织经浓度逐渐降低的ＳＳＣ溶液漂洗，碱性 子量为３６ ｋＤ的核磷蛋白，为８一ＤＮＡ聚合酶的一个辅助蛋白，是 ＤＮＡ复制及细胞增殖所必需的，其表达水平是反映细胞增殖活性的较好 指标；０）ｐ１６组化阳性百分率与肿瘤大小、侵袭力、复发密切相关，相应不 同组之间存在着明显的差异ｆＰ＜０．０５）。但最近的研究表明，在部分良性 和恶性肿瘤中均观察到ｐ１６蛋白表达增高的现象，且结合临床病理资料 分析可见ｐ１６免疫组化阳性的病例Ｉ临床表现较差，其高表达可能与不良 预后有关。对于ｐ１６这一抑癌基因在恶变细胞中反而表达增多这一似乎 矛盾的现象，Ｔａｍ等在对一系列恶性肿瘤细胞株的研究中发现，部分肿 磷酸酶联结的抗地高辛抗体４￣Ｃ温育过夜。碱性磷酸酶催化底物 ＮＢＴ／ＢＣＩＰ暗环境中显色。 ２结果 ２．１ ｐ１６免疫组化 瘤的细胞株发生了缺失，部分肿瘤的细胞株中ｐ１６表达水平较之相应的 正常细胞要明显增高。这一现象提示ｐ１６基因的缺失或是过表达与肿瘤 细胞的类型有关，即在不同的肿瘤中ｐ１６的改变可能有所不同，即使在 同种肿瘤的不同亚型，ｐ１６的改变也可能有所不同。 参考文献 【１］王静垂体腺瘤Ｐ１６基因免疫组化检测的意义现代临床医学２０１２，１（８）：９０ ［２】刘丽垂体腺瘤原位杂交检测的意义中国免疫学杂志２０１３，８（４）：３４ 阳性反应物位于细胞核部位，呈清晰棕色。各例中均可见到ｐ１６阳 性肿瘤细胞，其中许多为体积较大、细胞核圆且大、核浆比例也较大的细 胞，有些阳性染色很强呈深棕色，有些稍弱呈棕黄色。在不同的病例中， 阳性细胞百分率差异较大，约在５％～９５％之间。组织中绝大多数间质细 胞呈阴性，经苏木素复染后细胞核为蓝色，其余呈弱阳性，即细胞核呈淡
