ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程
DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】 ABI PRISM
310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。
由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1．BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA
polymerase FS，反应缓冲液等。
2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。
4．DNA测序模板
可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物
需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6．灭菌去离子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。
8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc?3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。
9．70%乙醇和无水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。
11．POP 6测序胶 ABI产品。
12．模板抑制试剂(TSR) ABI产品。
13．10×电泳缓冲液 ABI产品。
14．ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。
15．2400型或9600型PCR仪。
16．台式冷冻高速离心机。
17．台式高速离心机或袖珍离心机。
【操作步骤】
1．PCR测序反应
(1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1μl 1μl
待测的质粒DNA 1μl －
pGEM-3Zf (+) 双链DNA － 1μl
待测DNA的正向引物 1μl －
M13(-21)引物 － 1μl
灭菌去离子水 2μl 2μl
总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10s，50℃
5s，60℃4min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
2．醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。
(2) 加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
(3) 加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12 000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15min。
3．电泳前测序PCR产物的处理。
(1) 加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。
(3) 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，待上机。
4．上机操作
按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5．仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
6．测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650×100%
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1．ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。
2．本实验测序PCR反应的总体积是5μl，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5μl，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。
3．作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90ng，单链DNA需50～100ng，双链DNA需200～500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5)
%，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650bp，则需设计另外的引物。为保
证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。
一．Pump Block的清洁及维护
在机器运行前，必须确认Pump Block是干净的，使用POP-6测序时，注意POP-6室温下4天须更换。
1. 打开310主机，然后打开Macintosh微机， 打开Data Collection软件。
2. 在Instrument菜单下，选择manual control。
3. 选中syringe home，点execute执行。
4. 取下1ml玻璃注射器，去离子水洗净，晾干。
5. 松开capillary fitting，取下毛细管。
6. 取下buffer reservior
7. 双手执稳pump block，均匀用力，将其径直拔出。
8. 取5ml塑料注射器，用去离子水反复清洗pump block，特别注意管路的清洗。
9. 晾干后装上block，并装上毛细管。
二．安装毛细管，灌胶
1. 从4°C冰箱取出POP－6胶，室温回温30分钟。
2. 吸取少量 POP－6，将注射器来回抽动几次使胶浸润注射器内壁，然后将胶排净。
3. 吸取POP－6适量（≈0.2ml），用DI H2O洗净注射器外壁，擦干，于Pump Block 右侧上紧。将胶放回4°C冰箱。
4. 重新装好毛细管。
5. 进入Manual Control菜单，关闭缓冲阀门(Buffer Valve Close)，松开废液阀门, 手指压注射器排净管道中气泡，关上阀门(Buffer Valve Close)。
6. 进入Manual Control菜单，打开缓冲阀门(Buffer Valve Open), 同样方法排净管道中气泡，然后关闭缓冲阀门。
7. 松开capillary fitting，排净毛细管一侧的气泡，关紧fitting，注意毛细管顶端位于管路十字架的右边缘。
8. 将毛细管固定于检测窗口holder处，注意毛细管窗口之清洁（可用无水乙醇清洗）, 毛细管窗口应与机器检测窗口位置的吻合（此点可用毛细管上的Marker位于检测窗边缘来证实）。
9. 毛细管另一端插入电极端，使尖端比电极略低约0.5mm，同时用手指轻轻左右调节毛细管,使之尖端贴近电极尖端(间隔约2毫米)，调好后用胶带固定，合上控温板门。
10. 在Instrument 菜单下执行Autosampler Calibration 命令, 出现Autosampler Calibration 窗口, 根据右下角的提示进行操作。
11. 打开Manual Control, 执行 Syringe Home, 然后选择Syringe Down，输入合适的值并执行，使曲柄几乎与注射器的活塞顶部接触。
12. 具体方法：可先输入较大的值，如200，然后待靠近后，将值减少，如100, 50, 20, 5…。
三．样品准备
1. 将10 X Buffer 稀释到1 X Buffer（需约15ml）。
2. 将1 X Buffer加入到Buffer Reservior 及1号Buffer Vial，注意将液面达到Marker。
3. 2号位为装有约4ml DI H2O的Buffer Vial, 3号位为注入DI H2O的去盖1.5ml eppendorf管。
4. 用适量的TSR溶解测序样品（根据试剂盒的Protocol），变性，冰上剧冷后，转入专用0.5ml样品管，盖好septa。
5. 于Manual Ctrl中，执行Autosampler HomeX,Y axis和Autosampler Home Z axis 命令。
6. 按Pump Block左边的Tray键，待自动样品盘伸出后将上述样品及试剂放置到相应位置，按Tray退回，关好前门。
四．测序程序的运行
1. 于打开的收集软件之File菜单中选中New。
2. 于跳出的菜单中选Seq. Sample Sheet. 48Tube or 96 Tube，（依Tray的不同而定）
3. 以样品的实际位置为准输入相应的样品名并选择相应的mobility file和instrument file(Matrix file)。
4. 存盘(save) 关掉Sample Sheet。
5. 同上所述再次选New，于眺出菜单中选Seq. Inj List。
6. Seq. Inj List表中，可见Sample Sheet下拉菜单，选中刚才编好的Sample Sheet（有时间及日期显示名）。
7. 在第一个样品前须做一个Test CCD 4-Color程序。具体方法是，用鼠标选中Inj#项的No.1，于Edit 下拉菜单中，选中Insert，有一个空行插入于表的No.1处。任选一个Tube & Sample Name后，于Module下拉菜单处，选Test CCD 4-Color，不选择自动分析即完成。正常情况下4条信号线应在2048（Y轴值）以下，如高于次值则需暂停机器并将毛细管窗口擦净后再继续运行。
8. 编好 Inj List后，存盘(save)（注意Module 的选择）。
9. 选择Run运行此编好 Inj List。
五．测序结果的分析
一般分析软件可对结果进行自动分析, 用户可直接打开Sample file查看测序结果。如果用户想对
样品重新分析， 可按以下步骤进行。
1. 双击打开Sequence Analysis 软件，有一个Sample Manager页面弹出。
2. 点一下Add File, 有一个菜单弹出， 找到要分析的原始数据所在的文件夹（位于HD/ABI PRISM 310/RUNS中），加入需分析的原始数据， 加完后点一下Done。
3. 针对不同的样品的原始数据进行的分析，须注意不同的Dye Set/Primer file, Instrument File的选定。
4. 编好Sample Manager后， 点一下Start开始分析。
5. 双击分析完的Sample File Name, 可得到测序结果。
