第二节 基因测序技术进展
基因测序技术处于不断更新换代阶段，它的发展是推动基因组学发展的中坚力量。回顾基因测序技术的发展变迁，大致可以分为三代，即第一代测序技术、第二代测序技术和第三代测序技术。
一、第一代基因测序技术
传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA 测序技术，如荧光自动测序技术、杂交测序技术，统称为第一代DNA 测序技术。第一代基因测序技术曾经在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划的完成主要基于第一代基因测序技术。
（一）化学降解法
化学降解法是根据某些化学试剂可以使DNA 链在特定的一个碱基或两个碱基处发生专一性断裂的特性，对待测DNA 末端进行放射性标记，通过5 组（或4 组）相互的化学反应分别得到部分降解产物。由于每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割，因此，在反应后可得到5 组（或4 组）长短不一的放射标记的DNA 片段。每组中每个DNA 片段都有放射性标记的共同起点，但DNA 片段的长度取决于该组反应针对的碱基在原DNA 片段上所处的位置。最后，各组反应物通过聚丙烯酞胺胶电泳进行分离，再通过放射自显影检测末端标记的分子，即可直接读取待测DNA 片段的核昔酸序列闭。
因为化学降解法所测序列来自原DNA 分子而不是酶促合成产生的拷贝，所以排除了
模板资料 资源共享
合成时造成的错误。化学降解法在问世之初，凭借较高的准确性，且较易为普通研究人员所掌握的优点，被广泛使用。但由于化学降解法繁琐的操作步骤，逐渐被简便快速的DNA 链末端合成终止法所替代。
（二）DNA 链末端合成终止法
DNA 链末端合成终止法又称为Sanger 法，DNA 链末端合成终止法与化学降解法的区别在前者是利用DNA 合成时的末端终止，后者需要对原DNA 进行解旋变性和化学降解。Sanger 法的基本原理是将ddNTP掺人到合成的DNA 链中，由于聚合酶链延伸需要3 ’-OH 基团，而脱氧核糖上没有3 仁OH 基团，因此不能与下一个核昔酸反应形成磷酸二醋键，导致DNA合成反应终止。在进行测定时，首先将模板分为4个反应管，分别加入引物和DNA 聚合酶及32P 或35S 任意一种标记的4 种ddNTP 形成混合底物。4 组反应体系反应一定时间后，分别按比例加人4 种ddNTP 中的一种，因为ddNTP 没有3 仁OH 基团，所以只要是双脱氧核昔掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核昔，链就可以继续延长。最后获得4 组分别以各自的双脱氧碱基为3 忆端的一系列长度不等的DNA 片段。通过高分辨率变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离这些片段，随后利用放射自显影，根据片段3 忆端的双脱氧核昔，便可依次读出合成片段的碱基排列顺序。
因为DNA 链末端合成终止法操作简便，所以应用广泛。后来发展形成的多种DNA 测序技术部分是基于此法，其中最重要的当属荧光自动测序技术。
（三）荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于DNA 链末端合成终止法原理，所不同的是用荧光标记代替同位素标记，采用成像系统进行自动检测，使得DNA 测序速度更快、准确性更高。荧光自
模板资料 资源共享
动测序技术采用不同的荧光分子标记4 种双脱氧核昔酸，然后进行Sanger 测序反应，反应产物经平板电泳或毛细管电泳后分离后，通过4 种激光激发不同大小DNA 片段上的荧光分子使之发射出4 种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA 碱基的排列顺序。
（四）杂交测序技术
杂交测序法是将一系列已知序列的单链寡核昔酸片段固定在基片上，把待测的DNA 样品片段变性后与其杂交，根据杂交结果排列出样品的序列信息［5 , 6 〕 。杂交测序技术具备第二代基因测序技术测定速度快、成本低的特点，但其误差较大，不能重复测定，技术仍有待改进。
二、第二代基因测序技术
DNA 测序技术在过去几十年里发生了翻天覆地的变化，在第一代测序技术的基础上逐渐发展成为第二代测序技术。它逐渐克服了第一代测序技术操作步骤繁琐、效率低和速度慢等缺点，不断得到创新与改良。第二代测序技术主要包括使用合成法测序（Sequencing by Synthesis ）的罗氏454 公司4 的GSFLX 测序平台和Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer 测序平台，以及使用连接法测序（Sequencing by Ligation ）的ABI 公司的SOLID 测序平台。在保证基因组测序准确度的前提下，第二代测序技术操作程序逐步优化，测定通量急速增加，测试成本也呈下降趋势。
（一）454 侧序法
454 测序技术主要是利用了焦磷酸测序原理。其具体操作步骤如下：
模板资料 资源共享
① DNA 文库准备：将基因组DNA 打碎成300 一80Obp 长的片段，在单链DNA 的3 ’一端和5 ’一端分别连上不同的接头。
② 连接：带有接头的单链DNA 文库被固定在特别设计的DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA 片段引物。随后扩增试剂将磁珠乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。
③ 扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行各自的扩增，排除了其他可能竞争或污染序列的影响。如此，整个DNA 片段文库进行平行扩增。对于每一个片段而言，扩增完成后产生了成千上万个相同的拷贝。随后打破磁珠乳化混合物，扩增的片段仍然结合在磁珠上。
④ 测序：携带DNA 的捕获磁珠被放人只能容纳一个磁珠（ZOnm ）的直径为29 μm 的PTP 板中进行测序。放置在4 个单独的试剂瓶里的4 种碱基，依照T 、A 、C 、G 的顺序依次循环进人PTP 板，每次只进人一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过合成反应和化学发光反应后将萤光素氧化成氧化萤光素，释放出光信号，同时被仪器配置的高灵敏度CCD 捕获到。一旦一个碱基和测序模板配对，就会捕获到一分子的光信号，如此操作就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
454 测序技术也称为焦磷酸测序，与其他第二代测序技术相比，454 测序法的优点是读长。目前运用454 测序原理的GSFLX 测序系统的序列读长已超过400bp。
（二）Solexa 测序法
模板资料 资源共享
Solexa 测序技术是由英国剑桥大学派生的Solexa 公司创建的，该技术以单分子阵列技术为基础，是在合成测序技术的基础上发展得来。其具体操作步骤如下。
① 基因组DNA 样品的准备：将DNA 片段打碎成10 。一200 个碱基的小片段，随机地在小片段的两个末端加上接头。
② 固定DNA : DNA 片段变成单链后，通过接头与芯片表面的引物根据碱基互补配对原则，使一端被“固定”在芯片上。
③ 架桥：DNA 片段另外一端随机地和附近另外一个引物碱基互补，也被“固定”，形成片段架桥。
④ 产生DNA 簇：经过几十轮扩增，每个单分子扩增约1000 倍，成为单克隆DNA 簇；单克隆DNA 簇产生后，随即被线性化。
⑤ 测序：加人改造后的DNA 聚合酶和带有4 种荧光标记的ddNTP 。在DNA 合成时，每个核昔酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐，可作为能量提供给生物发光蛋白发出荧光。不同的碱基用不同的荧光标记可激发出不同波长的荧光。实时读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核昔酸发出的荧光后，将这些荧光基团的3‘-端经基化学切割，恢复3 ’-端薪性，随后添加第二个核昔酸。如此循环，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。最后，统计每轮收集到的荧光信号结果，即可得到每个模板DNA 片段的序列。
Solexa 测序的特点是不受物种，对人、动物、微生物和植物都可进行研究；高灵敏度、精确性及重复性；不需要预先知道模式物种基因组序列，也不需要测前合成探针，就可以直接进行全基因组表达的研究；无需实验假设的支持；可检测到单拷贝分子的变化；
模板资料 资源共享
无传统方法的荧光背景噪声的干扰。
（三）SOLID 测序法
SOLID 全称为Supported 01190 ligation detetion ，是ABI 公司于2007 年底推出的全新测序技术，已发展到SOLID 3 PluS 。SOLID 测序技术不同于与454 和Solexa 的合成测序，它的特点在于以四色荧光标记寡核昔酸的连续连接合成为基础，取代传统的聚合酶链反应（PcR , polymerase chaln re - action ) ，可对单拷贝DNA 片段进行大规模扩增以及高通量并行测序。SOL - iD3 系统就通量而言，技术的改进是性的。其具体操作步骤如下。① 文库准备：SOLID 系统支持两种测序模板，一个是片段文库（frag - ment library ) ，另一个是配对末端文库（mate 一paired library ）。片段文库就是将基因组DNA 打断成几百个碱基的小片段，两端加上接头形成的片段文库。该文库适用于转录组测序、miRNA 研究、RNA 定量、重测序、甲基化6 分析和CMP 测序等。配对末端文库是将基因组DNA 打断后，与中间接头连接，环化，再用EcoP15 酶切，使中间接头的两端各具有27 bp 的碱基，两端加上接头，制成文库。该文库适用于全基因组测序、结构重排、SNP 分析和拷贝数分析等。
② 扩增：与454 测序法类似，在微反应器中加人测序模板、PCR 反应元件、微珠和引物形成磁珠乳化混合物，进行扩增。扩增结束后，磁珠表面就固定有同一DNA 模板拷贝数目巨大的扩增产物。
③ 连接：扩增结束后，模板变性，富集带有延伸模板的微珠，微珠上的模板经过3 忆修饰，能够与玻片共价结合。因为每张玻片能容纳更高密度的微珠，所以在同一系统中可以轻松实现更高的通量。SOLID 测序反应在SOLID 玻片表面进行，每个磁珠经SOLID 测序后可得到一条序列。④ 测序：SOLID 连接反应的底物是一个被荧光标记的sbp 长的核
模板资料 资源共享
酸探针片段。这段sbp 长的核酸探针片段是经过设计的，假如其中第五位碱基上标记了荧光，连接反应完成后，就可以采集荧光图像。在第五位碱基和第六位碱基之间被切断，去掉荧光标签。如此反复，即可获得每间隔四个碱基的第五号碱基的确切信息，比如第5 位碱基、第10 位碱基、第15 位碱基以及第20 位碱基等。经过几轮循环之后，已经获得延伸的引物会变性脱落，再重新结合上新的引物从头开始新一轮测序，不过这次可能获得的是第4 、9 、14 、19 位碱基的信息。在实际操作中，使用不同长度的引物（十1 或者一l ) 或者使用在不同位点（比如第2 号碱基）标记荧光的sbp 核酸探针片段可以达到这个目的。采用这种方式，最终就可获得整条模板片段的完整序列信息。
以上这些新型测序法均使用了一种新的测序策略，即循环芯片测序法（Cyclic - - array Sequencing ）。所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA 样品的芯片重复进行基于DNA 的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。
三、第三代基因测序技术
目前，出现了以单分子测序为特点的第三代DNA 测序技术，如生物科学公司（Bioscience Corporation ）的Heliscope 单分子测序仪（Heliscope 7 Single Sequencer ）以及正在研制的太平洋生物科学公司（Pacific Biosci - ences ）的单分子实时DNA 测序技术〔 Single Molecule Real Time ( SMRT ) DNA Sequencing Technology 」和牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd ）的纳米孔单分子测序技术等。
（一）Heliscope 测序仪
模板资料 资源共享
Heliscope 测序仪是由Quake 团队设计开发的，它也是一种循环芯片测序设备。与第二代测序技术不同的是，Hehscope 测序仪无需对测序模板进行扩增，它使用了一种高灵敏度的荧光探测仪可以直接对单链DNA 模板进行合成法测序。具体步骤是：① 将基因组DNA 打断成随机的小片段DNA 分子，并在每个DNA 片段末端加上poly 一A 尾；② 通过Poly 一A 尾和固定在芯片上的poly 一T 杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片；③ 借助聚合酶将荧光标记的单核昔酸掺人到引物上，采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应。如此反复，最终获得完整的序列信息。根据最近的报道，经过数百轮这种单碱基延伸可以获得25bp 或更长的测序长度［' 5 , ' 6 〕 。
（二）单分子实时ONA 测序技术
太平洋生物科学公司的单分子实时DNA 测序技术，能够实时开展、监控并分析单分子生化反应。其使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集荧光所发射的光脉冲，实现对整个过程监测。另外，它还使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT 碱基。当测序开始后，实时的数据就传送到初步分析流水线，进而识别碱基和质量值。荧光脉冲的到达时间和持续时间反映了有关聚合酶动力学的信息，所以可以直接检测DNA 模板链中的修饰核昔酸，包括N6 一甲基腺嚓吟、5 一甲基胞嗜陡和5 一轻甲基胞嚓陡。根据各种修饰对聚合酶动力学的不同影响，可以将它们区分开［, ' , ' 8 〕 。
（三）纳米孔单分子测序技术
在纳米孔测序技术中，DNA 分子被称为核酸外切酶的蛋白质以一次一个碱基的速度通过小孔。核酸外切酶不但可以准确地区分4 个DNA 碱基编码：A 、T 、C 、G ，同时也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在70 天左右测定一个完整的基因序列。纳米孔技术不需要荧光标记物，同时也很可能不需要进行扩增，就能直接并快速“读”出
模板资料 资源共享
DNA 。使用该技术测序比较廉价，进而促使进行大量重复实验成为可能。纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，该芯片可以在一台机器上操作，快速并且廉价地给大量DNA 进行排序。
在过去几十年里基因测序技术飞速发展，测序更快、方法更简便、成本更低。未来在较短的时间内花费1000 美元测一个人的基因组将不再是梦想。简便、快速、经济的基因测序技术，不仅可以对人类熟悉的物种基因进行测序、指导科研工作者更合理地进行实验设计，进而推动生物学的研究进展；另外，基因测序技术的飞速发展对人类进人个体医疗时代也具有促进作用。
模板资料 资源共享
