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一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用[发明专利]

来源：刀刀网

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 111690751 A(43)申请公布日 2020.09.22

(21)申请号 202010666782.8(22)申请日 2020.07.13

(71)申请人青岛大学附属医院

地址 266000 山东省青岛市黄岛区五台山

路1677号(72)发明人刘世海　潘华政　贺桂芳　刘畅畅　

蔡铎　(74)专利代理机构青岛合创知识产权代理事务

所(普通合伙) 372

代理人王晓晓(51)Int.Cl.

C12Q 1/6886(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书8页说明书15页序列表28页附图3页

CN 111690751 A(54)发明名称

一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用(57)摘要

本发明提供了一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用，本发明所述PCR试剂包括检测ABCC1基因、AKT1基因、AKT2基因、ATF2基因、AURKA基因和AURKB基因等相关基因和内参基因等的PCR反应引物。本发明将涉及靶标肿瘤药物集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞对药物反应的核心分子，以药物处理的肝癌Huh7、未处理的肝癌Huh7做对比进行举例，探讨引起药物处理的核心信号分子的可能途径，为研究关键蛋白的提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到肿瘤药物靶标的核心信号分子，为新靶向药物的机制探讨、靶向肿瘤抑制剂的开发等提供了有力的工具。

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1.一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂，其特征在于它包括以下引物：（1）检测ABCC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TACTCATTCAGCTCGTCTTGT -3'；5'- AGGGATTAGGGTCGTGGA-3'；（2）检测AKT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCATCGAACGCACCTTCCA-3'；5'-GCTTCAGGTACTCAAACTCG -3'；（3）检测AKT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTGCAGAGATTGTCTCGG -3'；5'-CCCGGCCATAGTCATTGT -3'；（4）检测ATF2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CACAGCCCACATCAGCTAT -3'；5'-GTGCCTGGGTGATTACAG -3'；（5）检测AURKA基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGGTGGTCAGTACATGCT -3'；5'- GCATCCGACCTTCAATCATTT -3'；（6）检测AURKB基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGAAGAGCTGCACATTTGAC -3'；5'- CTTGAGCCCTAAGAGCAGATT -3'；（7）检测AURKC基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCGCACAGCCACGATAATA -3'；5'- GCGGCAAGTAGTCCAGT-3'；（8）检测BCL2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTGGGGTCATGTGTGTG -3'；5'- GGTTCAGGTACTCAGTCATC -3'；（9）检测BIRC5基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGACCACCGCATCTCTACA -3'；5'-AGTCTGGCTCGTTCTCAGT -3'；（10）检测CDC25A基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCCTCTTTTTACACCCCAGTC -3'；5'- CGGTTGTCAAGGTTTGTAGTT -3'；（11）检测CDK1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GATGTGCTTATGCAGGATTC -3'；5'- ATGTACTGACCAGGAGGGATA -3'；（12）检测CDK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TACCTCCCCTGGATGAAGA -3'；5'- GAAATCCGCTTGTTAGGGT -3'；（13）检测CDK4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGGTGTTTGAGCATGTAGAC -3'；

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5'- ATCCTTGATCGTTTCGGCT -3'；（14）检测CDK5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TTTTCCCGGCAATGATGTC -3'；5'- CAGCTTGGTCATAGAGGG -3'；（15）检测CDK7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTATGGTGTAGGTGTGGAC-3'；5'- GCAAAGGTATTCCAGGGAAA-3'；（16）检测CDK8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCCAGTTCAGTTACCTCG -3'；5'- TGTGCAACACCCAGTTAGC -3'；（17）检测CDK9基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TAACCGCTGCAAGGGTAGT -3'；5'-TGACCAAAACATTGCTCAACA -3'；（18）检测CTSB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GAGTTATGTTTACCGAGGACC -3'；5'- ATGCAGATCCGGTCAGAG-3'；（19）检测CTSD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TTCAGGGCGAGTACATGATC -3'；5'- GACACCTTGAGCGTGTA -3'；（20）检测CTSL基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ACCGGCTTTGTGGACAT -3'；5'- TGACCTGCATCAATAGCAAC -3'；（21）检测CTSS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTAGATGCGCGTCATCCTT -3'；5'- CAACCACAAGTACACCATGA -3'；（22）检测EGFR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGCCGCAAAGTGTGTAAC -3'；5'- TCACCCCTAAATGCCACC -3'；（23）检测ERBB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGCCTGTGCCCACTATAA -3'；5'-GGAGAGGTCAGGTTTCACA-3'；（24）检测ERBB3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACCCAGGTCTACGATGGGA -3'；5'- TGAGCTGAGTCAAGCGGA -3'；（25）检测ERBB4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CAGATGCTACGGACCTTAC -3'；5'- ACACTGAGTAACACATGCTC -3'；（26）检测ESR1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AAAGGTGGGATACGAAAAGAC -3'；

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5'- CTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG -3'；（27）检测ESR2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCAAAGAGGGATGCTCACTT -3'；5'- CTTCACACGACCAGACTC-3'；（28）检测FIGF基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTCAGTGCAGCCCTAGAGA -3'；5'- AACACGTTCACACAAGGG -3'；（29）检测FLT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AAAACGCATAATCTGGGACAG -3'；5'-CGTGGTGTGCTTATTTGG -3'；（30）检测FLT4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCCGAGGAGCTACTAGAGG-3'；5'-GCGCAGATGCTCGTACTT-3'；（31）检测GRB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TTCCTGCGGGACATAGAAC -3'；5'- GTGACATAATTGCGGGGAAA -3'；（32）检测GSTP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ATCTACACCAACTATGAGGC -3'；5'-GCAGGGTCTCAAAAGGCTT -3'；（33）检测HDAC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCCCTCACAAAGCCAAT-3'；5'- TGCTTGCTGTACTCCGAC-3'；（34）检测HDAC11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGTGCCCATCCTTATGGT -3'；5'- AGCGGTGTGTCTGAGTTC -3'；（35）检测HDAC2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGCTGTGAAGTTAAACCGAC -3'；5'- CCGTCATTACACGATCTGTT -3'；（36）检测HDAC3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTGGCTTCTGCTATGTCAAC -3'；5'- CCGGTCAGTGAGGTAGAAA -3'；（37）检测HDAC4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCGTCCGTTGGATGTCA-3'；5'- CTTCTCGTGCCACAAGTC -3'；（38）检测HDAC6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CCCCAGTGTCCTCTATTTCT -3'；5'- CTGGTTCCAAGGCACATTG-3'；（39）检测HDAC7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCCCAGTCCTTAATGACCA -3'；

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5'- ACCTGGACGTGAGTTTTGA -3'；（40）检测HDAC8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CGCTGGTCCCGGTTTATAT -3'；5'- ACTGGCCCGTTTGGGGA-3'；（41）检测HIF1A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ACCACAGGACAGTACAGGA-3'；5'- GTGCTGAATAATACCACTCAC -3'；（42）检测HRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGATCAAACGGGTGAAGGA -3'；5'- CCTGCCGAGATTCCACA-3'；（43）检测HSP90AA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTTGACCAATGACTGGGAA -3'；5'- GCTCCTCACAGTTATCCATG -3'；（44）检测HSP90B1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CAGTTTGGTGTCGGTTTCTA-3'；5'- TGGGTATCGTTGTTGTGTTTT-3'；（45）检测IGF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'；5'- CCTCCTTAGATCACAGCTC-3'；（46）检测IGF1R基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGCTGACCTCTGTTACCTC-3'；5'- GCTTATTCCCCACAATGTAGT -3'；（47）检测IGF2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGGCATCGTTGAGGAGT -3'；5'- ACGTCCCTCTCGGACTT -3'；（48）检测IRF5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTCAGTGCAAGGTGTTCTG -3'；5'- TTGCGGTCAGGCCATTC -3'；（49）检测KDR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ACGTGTCACTTTGTGCAAG -3'；5'- TCCATGAGACGGACTCAGA -3'；（50）检测KIT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTTGAGGTTTATTCCTGACCC -3'；5'- CAGACAGAGCCGATGGTA -3'；（51）检测KRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGTACAGTGCAATGAGGGA-3'；5'- CTGAGCCTGTTTTGTGTCTA-3'；（52）检测MDM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCAGGGGAGAGTGATACAG -3'；

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5'- AAGCCAATTCTCACGAAGG-3'；（53）检测MDM4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TTTGATCCCTGCAACTCAGT -3'；5'- TCTCGTGGTCTTTTCTCACA-3'；（54）检测MTOR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CAGATTTGCCAACTATCTTCG -3'；5'- AGCGGTAAAAGTGTCCCCT -3'；（55）检测NFKB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTGCGGCTCATGTTTACA-3'；5'- ATGGCGTCTGATACCACG -3'；（56）检测NRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGGGAGCAGATTAAGCGAG-3'；5'- GGCTTGTTTTGTATCAACTGT -3'；（57）检测NTN3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGTGACTCGCACTGCAAA -3'；5'- CTGCACCGCATAGTCCTT -3'；（58）检测PARP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTGAGCTTCGGTGGGATG-3'；5'- TGGCATACTCTGCTGCAAA -3'；（59）检测PARP2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GCACAAATCAAGGCAGGTT-3'；5'-AGTCATGCGGAATCCTGGT-3'；（60）检测PARP4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGTGAGGCCCTTGTTGCA-3'；5'- ACGATCTTCCACTACTTTGG -3'；（61）检测PDGFRA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGAAGGCAGGCACATTTAC -3'；5'-CGACAAGGTATAATGGCAGAA -3'；（62）检测PDGFRB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GATGCCGAGGAACTATTCATC-3'；5'-TTCTTCTCGTGCAGTGTCA -3'；（63）检测PGR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CCAGCATGTCGCCTTAGAA -3'；5'- GTGCTCTCACAACTCTGACT -3'；（）检测PIK3C2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTGTCAAAATCTGGCCCGA -3'；5'- GTGTCTCGTCATGGCTTC -3'；（65）检测PIK3C3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCTGGCCTAATGTAGAAGCA -3'；

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5'- GCAAGACGGCTCATCTGA -3'；（66）检测PIK3CA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GTAGGCAACCGTGAAGAAAA-3'；5'- AGGTGAATTGAGGTCCCTAAG -3'；（67）检测PLK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CTGCACCGAAACCGAGTTA -3'；5'- CGTCATATTCGACTTTGGTTG -3'；（68）检测PLK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CGTCGGTGTCCTTTTCAAC-3'；5'- TCCACCATCCATGAGGTTC -3'；（69）检测PLK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CCTGAGGCGGATGTATG-3'；5'- TCAGCCGTCTCAAAGGGA-3'；（70）检测PLK4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCTCGATACCTTCGTAGAGCT -3'；5'-TGAGTGACATCGTTCCATTG -3'；（71）检测PRKCA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGTCACAGTACGAGATGCAAA -3'；5'- CTTTCATTCTTGGGATCAGGA -3'；（72）检测PRKCB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GATTGGGATTTGACCAGCA -3'；5'- GGCACAGGCACATTGAAG -3'；（73）检测PRKCD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ACGCTGCCATCCACAAGAA -3'；5'- TTAATCCCTGCTTCACCAGT -3'；（74）检测PRKCE基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CGGGTGAAGCCCCTAAAG -3'；5'- GCTGCCGAAGATAGGTG-3'；（75）检测PTGS2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGCTGACTATGGCTACAAAAG -3'；5'- CGGGCAATCATCAGGCA-3'；（76）检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ATTGGCGCTTTTGGGTACA -3'；5'- GCAGCTCTCGTAGCCATTT -3'；（77）检测RHOB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TCCCCGAGAAGTGGGTC -3'；5'-GAGGTAGTCGTAGGCTTGG -3'；（78）检测TERT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- CGATTGTGAACATGGACTAC -3'；

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5'- ACGCTGAACAGTGCCTT -3'；（79）检测TNKS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGATCTCTGGCAGTTTACTC-3'；5'- CAATCTCTCCCTAAGCTCC -3'；（80）检测TOP2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- GGCTGTGGTATTGTAGAAAG-3'；5'- TGGCATCATCGAGTTTGGG -3'；（81）检测TOP2B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTTCGTGTAGAGGGGTCAA-3'；5'- CCGTCCACCTTTTGTAGTT-3'（82）检测TP53基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CAGCTTTGAGGTGCGTGTT -3'；5'- CCTTTCTTGCGGAGATTCTC-3'；（83）检测TXN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGAAGCAGATCGAGAGCAA -3'；5'- GTGGCTGAGAAGTCAACTACT -3'；（84）检测TXNRD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGGGCAATTTATTGGTCCTCA -3'；5'- CCAAGTAACGTGGTCTTTCA -3'；（85）检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- ATGTACGTTGCTATCCAGG -3'；5'- TCCTTAATGTCACGCACGA-3'；（86）检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGGCTATCCAGCGTACTCC -3'；5'- GGCAGGCATACTCATCTTT -3'；（87）检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- TGGGCTACACTGAGCAC -3'；5'- TGGGCTACACTGAGCAC -3'；（88）检测HPRT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AAAAGGACCCCACGAAGTG -3'；5'- GTCAAGGGCATATCCTACAACA -3'；（）检测RPLP0基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'- AGATTGGCTACCCAACTGT -3'；5'- GAAGGTGTAATCCGTCTCCA -3'。

2.权利要求1所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应用，其特征在于：所述细胞系为肝癌细胞系、肺癌细胞系、肾癌细胞系、卵巢癌细胞系、乳腺癌细胞系和脑胶质瘤细胞系。

4.根据权利要求2所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应

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用，其特征在于：所述检测试剂采用实时荧光定量PCR方法进行检测。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μl，上游引物0.1-0.2μmol，下游引物0.1-0.2μmol，cDNA模板25-100ng，灭菌蒸馏水补足到20 μl。

6.根据权利要求5所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应用，其特征在于：所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的2×SYBR® Premix Ex Taq聚合酶。

7.根据权利要求4所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，59℃，20秒，进行40个循环；溶解曲线分析95℃，15秒，至65℃，1分钟，按照4.4℃/秒进行梯度降温。

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一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用

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技术领域

[0001]本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用。

背景技术[0002]肿瘤目前已经是仅次于心脑血管疾病的人类第二大死因，为人们健康福利和社会经济发展带来了严重的负担，克服肿瘤是近数十年来人们努力追求的目标之一。肿瘤治疗靶点则是治疗肿瘤的基础，也是肿瘤精准治疗的基石。因此筛选特异性的肿瘤药物靶标，是当今科学研究的热点之一。[0003]以肝癌研究为例，近年来，肝癌发病率上升幅度在恶性肿瘤中排名前列。但临床治疗表明，肝癌对放射治疗和传统的化学药物治疗均不敏感。目前肝癌患者主要靠以索拉非尼为代表的抗肿瘤靶向药物进行治疗。这类药物可以抑制肝癌细胞的生长及其周围血管的生成。然而随着分子生物学的深入研究和发展，发现许多信号核心分子与肝癌发生发展、增殖转移及预后密切相关，而药物靶标筛选对于肿瘤的靶向性治疗具有重要的意义。发明内容

[0004]针对现有技术中如何确定肿瘤药物靶标筛选，本发明提供了一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用，本发明进行了相应的分子生物学核心分子的筛选，可以解释该类核心分子在肿瘤药物处理中的变化，本发明将涉及肿瘤药物靶标分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应靶标分子的变化，探讨在肿瘤细胞系经药物处理后，核心分子的变化，从而探讨肿瘤相关性药物蛋白的最直接的证据。[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：[0006]一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂，它包括以下引物：[0007](1)检测ABCC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：[0008]5'-TACTCATTCAGCTCGTCTTGT-3'(SEQ ID NO:1)；[0009]5'-AGGGATTAGGGTCGTGGA-3'(SEQ ID NO:2)；[0010](2)检测AKT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：[0011]5'-TCATCGAACGCACCTTCCA-3'(SEQ ID NO:3)；[0012]5'-GCTTCAGGTACTCAAACTCG-3'(SEQ ID NO:4)；[0013](3)检测AKT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：[0014]5'-GTGCAGAGATTGTCTCGG-3'(SEQ ID NO:5)；[0015]5'-CCCGGCCATAGTCATTGT-3'(SEQ ID NO:6)；[0016](4)检测ATF2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：[0017]5'-CACAGCCCACATCAGCTAT-3'(SEQ ID NO:7)；[0018]5'-GTGCCTGGGTGATTACAG-3'(SEQ ID NO:8)；[0019](5)检测AURKA基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0020][0021][0022][0023][0024][0025][0026][0027][0028][0029][0030][0031][0032][0033][0034][0035][0036][0037][0038][0039][0040][0041][0042][0043][0044][0045][0046][0047][0048][0049][0050][0051][0052][0053][0054][0055][0056][0057][0058]

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5'-GGGTGGTCAGTACATGCT-3'(SEQ ID NO:9)；5'-GCATCCGACCTTCAATCATTT-3'(SEQ ID NO:10)；(6)检测AURKB基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGAAGAGCTGCACATTTGAC-3'(SEQ ID NO:11)；5'-CTTGAGCCCTAAGAGCAGATT-3'(SEQ ID NO:12)；(7)检测AURKC基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCGCACAGCCACGATAATA-3'(SEQ ID NO:13)；5'-GCGGCAAGTAGTCCAGT-3'(SEQ ID NO:14)；(8)检测BCL2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTGGGGTCATGTGTGTG-3'(SEQ ID NO:15)；5'-GGTTCAGGTACTCAGTCATC-3'(SEQ ID NO:16)；(9)检测BIRC5基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GGACCACCGCATCTCTACA-3'(SEQ ID NO:17)；5'-AGTCTGGCTCGTTCTCAGT-3'(SEQ ID NO:18)；(10)检测CDC25A基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TCCTCTTTTTACACCCCAGTC-3'(SEQ ID NO:19)；5'-CGGTTGTCAAGGTTTGTAGTT-3'(SEQ ID NO:20)；(11)检测CDK1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GATGTGCTTATGCAGGATTC-3'(SEQ ID NO:21)；5'-ATGTACTGACCAGGAGGGATA-3'(SEQ ID NO:22)；(12)检测CDK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TACCTCCCCTGGATGAAGA-3'(SEQ ID NO:23)；5'-GAAATCCGCTTGTTAGGGT-3'(SEQ ID NO:24)；(13)检测CDK4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGGTGTTTGAGCATGTAGAC-3'(SEQ ID NO:25)；5'-ATCCTTGATCGTTTCGGCT-3'(SEQ ID NO:26)；(14)检测CDK5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TTTTCCCGGCAATGATGTC-3'(SEQ ID NO:27)；5'-CAGCTTGGTCATAGAGGG-3'(SEQ ID NO:28)；(15)检测CDK7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTATGGTGTAGGTGTGGAC-3'(SEQ ID NO:29)；5'-GCAAAGGTATTCCAGGGAAA-3'(SEQ ID NO:30)；(16)检测CDK8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCCAGTTCAGTTACCTCG-3'(SEQ ID NO:31)；5'-TGTGCAACACCCAGTTAGC-3'(SEQ ID NO:32)；(17)检测CDK9基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TAACCGCTGCAAGGGTAGT-3'(SEQ ID NO:33)；5'-TGACCAAAACATTGCTCAACA-3'(SEQ ID NO:34)；(18)检测CTSB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0059][0060][0061][0062][0063][00][0065][0066][0067][0068][0069][0070][0071][0072][0073][0074][0075][0076][0077][0078][0079][0080][0081][0082][0083][0084][0085][0086][0087][0088][00][0090][0091][0092][0093][0094][0095][0096][0097]

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5'-GAGTTATGTTTACCGAGGACC-3'(SEQ ID NO:35)；5'-ATGCAGATCCGGTCAGAG-3'(SEQ ID NO:36)；(19)检测CTSD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TTCAGGGCGAGTACATGATC-3'(SEQ ID NO:37)；5'-GACACCTTGAGCGTGTA-3'(SEQ ID NO:38)；(20)检测CTSL基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACCGGCTTTGTGGACAT-3'(SEQ ID NO:39)；5'-TGACCTGCATCAATAGCAAC-3'(SEQ ID NO:40)；(21)检测CTSS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTAGATGCGCGTCATCCTT-3'(SEQ ID NO:41)；5'-CAACCACAAGTACACCATGA-3'(SEQ ID NO:42)；(22)检测EGFR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGCCGCAAAGTGTGTAAC-3'(SEQ ID NO:43)；5'-TCACCCCTAAATGCCACC-3'(SEQ ID NO:44)；(23)检测ERBB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GGCCTGTGCCCACTATAA-3'(SEQ ID NO:45)；5'-GGAGAGGTCAGGTTTCACA-3'(SEQ ID NO:46)；(24)检测ERBB3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACCCAGGTCTACGATGGGA-3'(SEQ ID NO:47)；5'-TGAGCTGAGTCAAGCGGA-3'(SEQ ID NO:48)；(25)检测ERBB4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CAGATGCTACGGACCTTAC-3'(SEQ ID NO:49)；5'-ACACTGAGTAACACATGCTC-3'(SEQ ID NO:50)；(26)检测ESR1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3'(SEQ ID NO:51)；5'-CTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3'(SEQ ID NO:52)；(27)检测ESR2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TCAAAGAGGGATGCTCACTT-3'(SEQ ID NO:53)；5'-CTTCACACGACCAGACTC-3'(SEQ ID NO:54)；(28)检测FIGF基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTCAGTGCAGCCCTAGAGA-3'(SEQ ID NO:55)；5'-AACACGTTCACACAAGGG-3'(SEQ ID NO:56)；(29)检测FLT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AAAACGCATAATCTGGGACAG-3'(SEQ ID NO:57)；5'-CGTGGTGTGCTTATTTGG-3'(SEQ ID NO:58)；(30)检测FLT4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TCCGAGGAGCTACTAGAGG-3'(SEQ ID NO:59)；5'-GCGCAGATGCTCGTACTT-3'(SEQ ID NO:60)；(31)检测GRB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0098][0099][0100][0101][0102][0103][0104][0105][0106][0107][0108][0109][0110][0111][0112][0113][0114][0115][0116][0117][0118][0119][0120][0121][0122][0123][0124][0125][0126][0127][0128][0129][0130][0131][0132][0133][0134][0135][0136]

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5'-TTCCTGCGGGACATAGAAC-3'(SEQ ID NO:61)；5'-GTGACATAATTGCGGGGAAA-3'(SEQ ID NO:62)；(32)检测GSTP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ATCTACACCAACTATGAGGC-3'(SEQ ID NO:63)；5'-GCAGGGTCTCAAAAGGCTT-3'(SEQ ID NO:)；(33)检测HDAC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCCCTCACAAAGCCAAT-3'(SEQ ID NO:65)；5'-TGCTTGCTGTACTCCGAC-3'(SEQ ID NO:66)；(34)检测HDAC11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GGTGCCCATCCTTATGGT-3'(SEQ ID NO:67)；5'-AGCGGTGTGTCTGAGTTC-3'(SEQ ID NO:68)；(35)检测HDAC2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGCTGTGAAGTTAAACCGAC-3'(SEQ ID NO:69)；5'-CCGTCATTACACGATCTGTT-3'(SEQ ID NO:70)；(36)检测HDAC3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTGGCTTCTGCTATGTCAAC-3'(SEQ ID NO:71)；5'-CCGGTCAGTGAGGTAGAAA-3'(SEQ ID NO:72)；(37)检测HDAC4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCGTCCGTTGGATGTCA-3'(SEQ ID NO:73)；5'-CTTCTCGTGCCACAAGTC-3'(SEQ ID NO:74)；(38)检测HDAC6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3'(SEQ ID NO:75)；5'-CTGGTTCCAAGGCACATTG-3'(SEQ ID NO:76)；(39)检测HDAC7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCCCAGTCCTTAATGACCA-3'(SEQ ID NO:77)；5'-ACCTGGACGTGAGTTTTGA-3'(SEQ ID NO:78)；(40)检测HDAC8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CGCTGGTCCCGGTTTATAT-3'(SEQ ID NO:79)；5'-ACTGGCCCGTTTGGGGA-3'(SEQ ID NO:80)；(41)检测HIF1A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACCACAGGACAGTACAGGA-3'(SEQ ID NO:81)；5'-GTGCTGAATAATACCACTCAC-3'(SEQ ID NO:82)；(42)检测HRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGATCAAACGGGTGAAGGA-3'(SEQ ID NO:83)；5'-CCTGCCGAGATTCCACA-3'(SEQ ID NO:84)；(43)检测HSP90AA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTTGACCAATGACTGGGAA-3'(SEQ ID NO:85)；5'-GCTCCTCACAGTTATCCATG-3'(SEQ ID NO:86)；(44)检测HSP90B1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0137][0138][0139][0140][0141][0142][0143][0144][0145][0146][0147][0148][0149][0150][0151][0152][0153][0154][0155][0156][0157][0158][0159][0160][0161][0162][0163][01][0165][0166][0167][0168][0169][0170][0171][0172][0173][0174][0175]

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5'-CAGTTTGGTGTCGGTTTCTA-3'(SEQ ID NO:87)；5'-TGGGTATCGTTGTTGTGTTTT-3'(SEQ ID NO:88)；(45)检测IGF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'(SEQ ID NO:)；5'-CCTCCTTAGATCACAGCTC-3'(SEQ ID NO:90)；(46)检测IGF1R基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGCTGACCTCTGTTACCTC-3'(SEQ ID NO:91)；5'-GCTTATTCCCCACAATGTAGT-3'(SEQ ID NO:92)；(47)检测IGF2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGGCATCGTTGAGGAGT-3'(SEQ ID NO:93)；5'-ACGTCCCTCTCGGACTT-3'(SEQ ID NO:94)；(48)检测IRF5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTCAGTGCAAGGTGTTCTG-3'(SEQ ID NO:95)；5'-TTGCGGTCAGGCCATTC-3'(SEQ ID NO:96)；(49)检测KDR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACGTGTCACTTTGTGCAAG-3'(SEQ ID NO:97)；5'-TCCATGAGACGGACTCAGA-3'(SEQ ID NO:98)；(50)检测KIT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTTGAGGTTTATTCCTGACCC-3'(SEQ ID NO:99)；5'-CAGACAGAGCCGATGGTA-3'(SEQ ID NO:100)；(51)检测KRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGTACAGTGCAATGAGGGA-3'(SEQ ID NO:101)；5'-CTGAGCCTGTTTTGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:102)；(52)检测MDM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCAGGGGAGAGTGATACAG-3'(SEQ ID NO:103)；5'-AAGCCAATTCTCACGAAGG-3'(SEQ ID NO:104)；(53)检测MDM4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TTTGATCCCTGCAACTCAGT-3'(SEQ ID NO:105)；5'-TCTCGTGGTCTTTTCTCACA-3'(SEQ ID NO:106)；(54)检测MTOR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CAGATTTGCCAACTATCTTCG-3'(SEQ ID NO:107)；5'-AGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3'(SEQ ID NO:108)；(55)检测NFKB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTGCGGCTCATGTTTACA-3'(SEQ ID NO:109)；5'-ATGGCGTCTGATACCACG-3'(SEQ ID NO:110)；(56)检测NRAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGGGAGCAGATTAAGCGAG-3'(SEQ ID NO:111)；5'-GGCTTGTTTTGTATCAACTGT-3'(SEQ ID NO:112)；(57)检测NTN3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0176][0177][0178][0179][0180][0181][0182][0183][0184][0185][0186][0187][0188][01][0190][0191][0192][0193][0194][0195][0196][0197][0198][0199][0200][0201][0202][0203][0204][0205][0206][0207][0208][0209][0210][0211][0212][0213][0214]

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5'-TGTGACTCGCACTGCAAA-3'(SEQ ID NO:113)；5'-CTGCACCGCATAGTCCTT-3'(SEQ ID NO:114)；(58)检测PARP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTGAGCTTCGGTGGGATG-3'(SEQ ID NO:115)；5'-TGGCATACTCTGCTGCAAA-3'(SEQ ID NO:116)；(59)检测PARP2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GCACAAATCAAGGCAGGTT-3'(SEQ ID NO:117)；5'-AGTCATGCGGAATCCTGGT-3'(SEQ ID NO:118)；(60)检测PARP4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGTGAGGCCCTTGTTGCA-3'(SEQ ID NO:119)；5'-ACGATCTTCCACTACTTTGG-3'(SEQ ID NO:120)；(61)检测PDGFRA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGAAGGCAGGCACATTTAC-3'(SEQ ID NO:121)；5'-CGACAAGGTATAATGGCAGAA-3'(SEQ ID NO:122)；(62)检测PDGFRB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GATGCCGAGGAACTATTCATC-3'(SEQ ID NO:123)；5'-TTCTTCTCGTGCAGTGTCA-3'(SEQ ID NO:124)；(63)检测PGR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CCAGCATGTCGCCTTAGAA-3'(SEQ ID NO:125)；5'-GTGCTCTCACAACTCTGACT-3'(SEQ ID NO:126)；()检测PIK3C2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTGTCAAAATCTGGCCCGA-3'(SEQ ID NO:127)；5'-GTGTCTCGTCATGGCTTC-3'(SEQ ID NO:128)；(65)检测PIK3C3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3'(SEQ ID NO:129)；5'-GCAAGACGGCTCATCTGA-3'(SEQ ID NO:130)；(66)检测PIK3CA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTAGGCAACCGTGAAGAAAA-3'(SEQ ID NO:131)；5'-AGGTGAATTGAGGTCCCTAAG-3'(SEQ ID NO:132)；(67)检测PLK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CTGCACCGAAACCGAGTTA-3'(SEQ ID NO:133)；5'-CGTCATATTCGACTTTGGTTG-3'(SEQ ID NO:134)；(68)检测PLK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CGTCGGTGTCCTTTTCAAC-3'(SEQ ID NO:135)；5'-TCCACCATCCATGAGGTTC-3'(SEQ ID NO:136)；(69)检测PLK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CCTGAGGCGGATGTATG-3'(SEQ ID NO:137)；5'-TCAGCCGTCTCAAAGGGA-3'(SEQ ID NO:138)；(70)检测PLK4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0215][0216][0217][0218][0219][0220][0221][0222][0223][0224][0225][0226][0227][0228][0229][0230][0231][0232][0233][0234][0235][0236][0237][0238][0239][0240][0241][0242][0243][0244][0245][0246][0247][0248][0249][0250][0251][0252][0253]

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5'-TCTCGATACCTTCGTAGAGCT-3'(SEQ ID NO:139)；5'-TGAGTGACATCGTTCCATTG-3'(SEQ ID NO:140)；(71)检测PRKCA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGTCACAGTACGAGATGCAAA-3'(SEQ ID NO:141)；5'-CTTTCATTCTTGGGATCAGGA-3'(SEQ ID NO:142)；(72)检测PRKCB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GATTGGGATTTGACCAGCA-3'(SEQ ID NO:143)；5'-GGCACAGGCACATTGAAG-3'(SEQ ID NO:144)；(73)检测PRKCD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ACGCTGCCATCCACAAGAA-3'(SEQ ID NO:145)；5'-TTAATCCCTGCTTCACCAGT-3'(SEQ ID NO:146)；(74)检测PRKCE基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CGGGTGAAGCCCCTAAAG-3'(SEQ ID NO:147)；5'-GCTGCCGAAGATAGGTG-3'(SEQ ID NO:148)；(75)检测PTGS2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGCTGACTATGGCTACAAAAG-3'(SEQ ID NO:149)；5'-CGGGCAATCATCAGGCA-3'(SEQ ID NO:150)；(76)检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACA-3'(SEQ ID NO:151)；5'-GCAGCTCTCGTAGCCATTT-3'(SEQ ID NO:152)；(77)检测RHOB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TCCCCGAGAAGTGGGTC-3'(SEQ ID NO:153)；5'-GAGGTAGTCGTAGGCTTGG-3'(SEQ ID NO:154)；(78)检测TERT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CGATTGTGAACATGGACTAC-3'(SEQ ID NO:155)；5'-ACGCTGAACAGTGCCTT-3'(SEQ ID NO:156)；(79)检测TNKS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GGATCTCTGGCAGTTTACTC-3'(SEQ ID NO:157)；5'-CAATCTCTCCCTAAGCTCC-3'(SEQ ID NO:158)；(80)检测TOP2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GGCTGTGGTATTGTAGAAAG-3'(SEQ ID NO:159)；5'-TGGCATCATCGAGTTTGGG-3'(SEQ ID NO:160)；(81)检测TOP2B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-GTTCGTGTAGAGGGGTCAA-3'(SEQ ID NO:161)；5'-CCGTCCACCTTTTGTAGTT-3'(SEQ ID NO:162)；(82)检测TP53基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-CAGCTTTGAGGTGCGTGTT-3'(SEQ ID NO:163)；5'-CCTTTCTTGCGGAGATTCTC-3'(SEQ ID NO:1)；(83)检测TXN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：

CN 111690751 A[0254][0255][0256][0257][0258][0259][0260][0261][0262][0263][02][0265][0266][0267][0268][0269][0270][0271][0272][0273][0274]

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5'-TGAAGCAGATCGAGAGCAA-3'(SEQ ID NO:165)；5'-GTGGCTGAGAAGTCAACTACT-3'(SEQ ID NO:166)；(84)检测TXNRD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGGGCAATTTATTGGTCCTCA-3'(SEQ ID NO:167)；5'-CCAAGTAACGTGGTCTTTCA-3'(SEQ ID NO:168)；(85)检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-ATGTACGTTGCTATCCAGG-3'(SEQ ID NO:169)；5'-TCCTTAATGTCACGCACGA-3'(SEQ ID NO:170)；(86)检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGGCTATCCAGCGTACTCC-3'(SEQ ID NO:171)；5'-GGCAGGCATACTCATCTTT-3'(SEQ ID NO:172)；(87)检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-TGGGCTACACTGAGCAC-3'(SEQ ID NO:173)；5'-TGGGCTACACTGAGCAC-3'(SEQ ID NO:174)；(88)检测HPRT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AAAAGGACCCCACGAAGTG-3'(SEQ ID NO:175)；5'-GTCAAGGGCATATCCTACAACA-3'(SEQ ID NO:176)；()检测RPLP0基因的PCR反应引物，其引物序列如下：5'-AGATTGGCTACCCAACTGT-3'(SEQ ID NO:177)；5'-GAAGGTGTAATCCGTCTCCA-3'(SEQ ID NO:178)。

本发明还提供了所述的PCR试剂在制备检测细胞系肿瘤药物靶标的检测试剂中的

应用。

进一步的：所述检测试剂适用于实时荧光定量PCR检测方法。

[0276]进一步的：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μl，上游引物0.1-0.2μmol，下游引物0.1-0.2μmol，cDNA模板25-100ng，灭菌蒸馏水补足到20μl。[0277]进一步的：所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的Premix Ex Taq聚合酶。[0278]进一步的：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，59℃，20秒，进行40个循环。溶解曲线分析95℃，15秒，至65℃，1分钟，按照4.4℃/秒进行梯度降温。

[0279]其PCR反应仪器为罗氏公司的LightCycler480。该对引物置于96孔板中，进行实时荧光定量PCR检测。可以通过一次反应获得关于肝癌药物靶标核心分子的变化。[0280]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供了检测肝癌药物、肾癌药物、乳腺癌药物、肺癌药物、脑胶质瘤药物、胃癌药物靶标核心分子变化的试剂，借助于所述检测试剂可以通过实时荧光定量在转录水平快速检测出与肿瘤药物靶标相关的基因，在此基础上分析研究其核心分子及作用机理，从而快速准确的找到肿瘤靶标药物的核心调节信号通路，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。

[0281]本发明通过大量的创造性实验确定了与肿瘤药物靶标筛选有关的84种基因，本发明重点在于引物的组合，通过实验证明只有通过适当的引物组合，才能避免在PCR扩增时出现引物二聚体、非特异性扩增的情形，保证所有目的基因的有效扩增。任意引物的组合往往

[0275]

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在具体PCR时候会出现引物二聚体而影响目的基因不能顺利扩增，或者会出现非特异性扩增情形，这将极大程度影响PCR结果的有效性。在同一个实验条件下，同时做个(其中84个基因为检测基因，5个为内参基因)基因的PCR检测，不仅需要引物设计好，还要把握好最佳的扩增条件，这个是技术难点。最核心的是引物设计，本发明是通过多次实验和调整后获得最佳的扩增条件，并且保证每个基因的扩增效率都很高，没有非特异性扩增。[0282]同时本发明还提供了检测的PCR方法，所述实验体系可以在任何一台实时荧光定量PCR仪器上进行，实验操作简便，费用低廉，结果重复性好，有利于减少下游不必要的检测，是研究肿瘤靶标药物作用机理的一种重要手段。[0283]结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

[0284]图1表明了本发明利用索拉非尼处理的肝癌细胞Huh7和未经处理的肝癌细胞Huh7差异表达的基因，其中1：索拉非尼处理的Huh7细胞；2：肝癌细胞Huh7。

[0285]图2表明了实时荧光定量PCR检测索拉非尼处理的Huh7肝癌细胞药物靶标分子的表达。

[0286]图3表明了CCK-8检测索拉非尼靶标分子BCL2对肝癌细胞增殖的影响。

[0287]图4表明了Edu染色检测索拉非尼靶标核心分子对肝癌Huh7细胞增殖的影响。[0288]图5表明了流式细胞仪检测索拉非尼靶标分子BCL2对肝癌细胞凋亡的影响。[02]图6表明了细胞划痕检测肝癌核心分子对Huh7迁移的影响。

[0290]图7表明了Transwell检测药物靶标核心分子对Huh7迁移的影响。

[0291]图8表明了小鼠肿瘤生成抑制实验检测肿瘤药物靶标筛选PCR试剂的有效性。具体实施方式

[0292]下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。[0293]实施例1

[0294]本发明通过索拉非尼处理的人肝癌Huh7、肝癌细胞Huh7进行举例说明，但是本发明并不限于这两种细胞，本发明所述检测试剂可以应用于包括SMMC7721，HCCLM3等肝癌细胞系，同时也可以检测临床肝癌组织以及癌旁组织肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤等其他肿瘤的药物靶标。

[0295]本发明通过培养人肝癌细胞系Huh7，然后采用索拉非尼(10uM)处理24小时，利用肿瘤药物靶标筛选PCR试剂检测处理的细胞系中核心药物靶标分子的变化。[0296]本发明中所用的人肝癌Huh7购自美国ATCC公司，上海细胞库、DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，用于提取总RNA的RNAiso，逆转录试剂盒，Premix Ex Taq试剂盒购买自TaKaRa。[0297]利用本发明所述PCR试剂检测肝癌药物靶标的核心分子包括以下具体步骤：[0298]一、人肝癌Huh7细胞系的培养与传代[0299]在60mm细胞培养板内加入1mL 0.2％胰酶溶液，轻轻摇动以使胰酶与细胞充分接触，37℃二氧化碳孵箱内孵育2min，镜下观察大部分细胞浮起后，加入4mL含10％FBS的DMEM

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培养基，吹匀后加入15mL离心管内，2000g离心6min，弃去上清，根据细胞种类加入相应的适当体积培养液，用10mL移液管反复吹打数次，使细胞游离。此过程中避免产生气泡，以免影响细胞计数。取细胞悬液20μL，滴入细胞计数板内，按细胞计数法计量四角四大格内细胞总数。计数时仅计数细胞形态完整的细胞，堆积的细胞按1个细胞计算。计算公式如下：[0300]细胞浓度(个/mL)＝(4大格细胞总数)×104×稀释倍数/4。[0301]根据细胞种类用相应的培养液细胞悬液稀释至5×106个/mL，在60mm细胞培养皿内加入细胞，每板2mL此细胞稀释液，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，细胞一般在0.5h-1h后贴壁，数小时后开始生长，24h-48h后成为单层细胞。[0302]采用索拉非尼(终浓度为10uM)加入培养基中，更换培养基处理Huh7细胞，然后与对照组共同孵育24小时。[0303]二、总RNA的提取

[0304]1)取CO2孵箱中处于对数生长期60mm平皿的细胞一盘，吸掉培养液后，用无菌1×PBS清洗2次后，在细胞表面加1mL RNAiso，用头反复抽吸均匀，转入无菌管中。[0305]2)室温培育5min，以溶解核蛋白。加0.2mL酚/氯仿(1:1)，剧烈振荡15sec，室温孵育2-3min。

[0306]3)4℃，12000g离心15min，细胞会产生分层。[0307]4)将上层液体转至无RNase的离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀3次，室温培育10min。

[0308]5)4℃，12000g离心10min，RNA形成底部沉淀。[0309]6)弃上清，用无RNase的75％乙醇1mL洗涤沉淀。4℃，7000g离心5min。[0310]8)空气中干燥RNA约5-10min。不宜太干。[0311]9)用30-50μL DEPC水溶解RNA。[0312]结果如图1所示，从图1中的电泳可以看出1泳道为Huh7，2泳道为正常肝细胞，总RNA的条带完整，适合做下游逆转录等实验。[0313]三、cDNA的合成

[0314]1)在预冷的试管中加入下列反应混合物：[0315]总RNA 1-5μg；oligo(dT)(0.5μg/μl)1μL；用RNase-free水定容至12μL。[0316]2)混匀，离心3-5sec。

[0317]3)70℃作用5min后冰浴30sec，离心3-5sec。[0318]4)将试管冰浴，再加入如下组分：5×Reaction buffer 4μL；Rnase Inhibiter(20U/μL)1μL；dNTP mix(10mM)2μL；[0319]5)轻轻混匀，离心3-5sec。[0320]6)37℃水浴5min，加1μL的M-MuLV Reverse Transcriptase(20U/μL)，混匀。[0321]7)37℃作用60min。70℃孵育10min结束反应，置冰上进行下游试验。[0322]四、实时荧光定量PCR

[0323]取合成好的cDNA为模板，按照以下体系进行实时荧光定量PCR反应：

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[0324]

在罗氏的LightCycler480仪器上设置如下程序：95℃预变性，30秒；95℃变性，5

秒，59℃，20秒，进行40个循环。溶解曲线分析95℃，15秒，至65℃，1分钟，按照4.4℃/秒进行梯度降温。

[0326]所述检测肿瘤药物靶标的PCR试剂为上述发明内容中所述的PCR试剂(包括有84个检测基因的引物和5个内参基因的引物)，序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:178所示。[0327]将上述引物置于96孔板上进行PCR反应，其中每对引物置于任一孔中，共将对引物置于个孔中即可。[0328]五、数据分析[0329]利用各个基因的Ct值计算肝癌药物靶标核心基因的表达差异。如图2所示，索拉非尼处理组的Huh7细胞与对照Huh7相比，MTOR，EGFR，BCL2，PDGFRB，ERBB2，PDGFRA，HIF1A等的表达均明显上调，而在已有的研究表明，MTOR，EGFR等该类基因与索拉非尼的临床用药具有明显的相关性，因此本发明所述的PCR试剂可以快速有效的筛选出与肿瘤药物靶标相关的分子。[0330]六、CCK-8检测BCL-2对索拉非尼处理组Huh7细胞增殖的影响[0331]采用Invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书进行6孔细胞培养板转染。[0332]1、转染前一天，以4*105/ml细胞Huh7密度接种到6孔培养板上。转染时，细胞要达到90～95％的融合。[0333]2、溶液1：240ul无血清培养基+10ul lipofectamine 2000每个孔(总体积250ul)(温育5min)[0334]3、溶液2：200ul无血清培养基+4ug pGenesil-BCL2质粒(命名为sh-BCL2)每个孔使总体积达到250ul。同时采用pGenesil-1的空白质粒作为对照，命名为sh-RNA。[0335]4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。[0336]5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml无血清培养基。[0337]6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5～6小时。[0338]7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中24h后消化细胞，按照每孔100微升2000个细胞加入到96孔培养板中。按照实验需要，进行培养并给予10uM微升索拉非尼处理。[0339]8、每孔加入10微升CCK-8溶液。用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。[0340]9、在细胞培养箱内继续孵育24,48,72小时。[0341]10、在450nm测定吸光度，将测得结果导入GraphPad进行计算。

[0325]

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结果如图3所示，但转染sh-BCL2或者索拉非尼(10uM)处理组，均有生长抑制，但是

转染sh-BCL2同时索拉非尼(10uM)组，其生长受到明显抑制(P<0.01)，进一步说明了索拉非尼和BCL2的下调的处理组肝癌细胞对肝癌的生长具有明显的抑制作用，该结果初步验证了本发明所述PCR试剂筛选核心药物靶标分子的有效性。[0343]七、采用Edu荧光法检测肝癌药物靶标核心分子对肝癌细胞增殖的影响[0344](一)培养细胞的EdU标记及固定、洗涤和通透[0345]a.在6孔板中培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行sh-BCL2和/或索拉非尼(10uM，该组标记为SR10)的处理。[0346]b.配制2X的EdU工作液：用细胞培养液1:500稀释EdU(10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。

[0347]c.将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。

[0348]d.继续孵育细胞2小时。该时间为细胞周期10％左右的时间。[0349]e.EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液(含有10％多聚甲醛的PBS溶液)，室温固定15分钟。[0350]f.去除固定液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。[0351]g.去除洗涤液，每孔用1ml通透液(0.3％Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。

[0352]h.去除通透液，每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。[0353](二)EdU检测[0354]a.配制Click Additive Solution：用1.3ml去离子水溶解一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装，并-20℃保存。[0355]b.参考表1配制Click反应液。注意：请严格按照表1中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。[0356]表1 Click反应液配制Click Reaction Buffer430μl

CuSO420μlAzide 5551μlClick Additive Solution50μl总体积500μl

[0358]c.去除上一步骤中的洗涤液。[0359]d.每孔加入0.5ml Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。

[0360]e.室温避光孵育30分钟。[0361]f.吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。[0362]g.参照以下步骤对细胞核进行染色。Azide 555的最大激发波长是555nm，最大发射波长是565nm。[0363](三)细胞核染色

[03]为了检测细胞增殖的比例，可以考虑使用DAPI进行细胞核染色。一般高内涵筛选

[0357]

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仪器也需要对细胞核进行染色。[0365]a.1X DAPI溶液的配制：按1:1000比例用PBS稀释DAPI(1000X)。[0366]b.接上述步骤，吸除洗涤液后，每孔加1X DAPI溶液1ml，室温避光孵育10分钟。[0367]c.吸除1X DAPI溶液。[0368]d.用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。[0369]e.随后即可进行荧光检测。DAPI为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。[0370](四)结果解读

[0371]采用干扰索拉非尼药物靶标分子BCL2的表达，可以抑制肝癌细胞Huh7的增殖，当加入索拉非尼处理24小时后，Huh7的增殖受到明显抑制，结果如图4所示，说明通过该药物靶标筛选PCR试剂得到的靶标分子，对于肿瘤药物的筛选以及测试肿瘤药物的作用机理具有明显的靶向性。[0372]八、采用流式细胞仪检测肝癌索拉非尼靶标分子BCL2对肝癌细胞凋亡的影响[0373]收集细胞：取适量的对数生长期Huh7细胞接种于6孔板中，在相应的条件下(如以上各种处理组)处理相应时间后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞；[0374]清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；[0375]分组：每一次实验分为不染组、单染Annexin V-PE组、单染7-AAD组以及7-AAD和Annexin V-PE双染组，处理组按从低到高进行双染；[0376]染色：用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液吹打细胞使细胞充分重悬，避光条件下加入染料。不染组不加，单染组加Annexin V-PE或7-AAD 5μL，Annexin V-PE和7-AAD双染组加入Annexin V-PE和7-AAD各5μL，并用移液轻轻混匀；[0377]上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在FACSCalibur流式细胞仪上机检测。[0378]结果如图5所示，与NC对照组相比，敲低表达BCL2组同时加入索拉非尼(10uM)组显著提高了Huh7肝癌细胞的凋亡。该结果进一步表明了本发明所述肿瘤药物PCR筛选试剂的有效性。[0379]九、细胞划痕检测索拉非尼靶标分子对肝癌细胞迁移的影响[0380]1.培养板划线：首先使用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。划线时注意线不要太粗。[0381]2.铺细胞：在孔中加入约5×105个细胞，待细胞贴壁后，将siRNA和/或索拉非尼对Huh7细胞进行处理，继续培养，待细胞融合率达到100％后进行下游实验。[0382]3.细胞划线：用头或者无菌牙签，垂直与细胞平面，沿着投一天划在平板背面的线在细胞层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只头或牙签)。[0383]4.洗细胞：划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划线的细胞，是划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基。[0384]5.细胞培养、观察：将细胞放入37℃5％CO2培养箱，培养。然后在24h后取出细胞，显微镜线观察并测量划痕的宽度，并拍照。[0385]6.结果分析：使用Image J软件打开图片后，随机划取6至水平线，计算细胞间

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距离的均值。

[0386]结果分析：采用细胞划痕实验检测索拉非尼靶标分子BCL2对Huh7细胞迁移的影响，结果发现在对靶标分子BCL2下调后，同时加入索拉非尼处理，其Huh7细胞的迁移率受到了明显抑制，该结果进一步验证了肿瘤药物靶标筛选PCR试剂的有效性(如图6所示)。[0387]十、Transwell实验检测药物靶标核心分子对细胞迁移的影响[0388]1.所有细胞培养试剂和细胞培养池放在37℃温育；[03]2.待测细胞培养进行索拉非尼或/和si-BCL2的处理，然后继续培养24小时，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105/ml；

[0390]3.在下室(即24孔板底部)加入800μl含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24h；

[0391]4.将其下表面浸泡在70％甲醇溶液中，固定30min～60min，用结晶紫，镜检，并计算PET膜下表面的细胞数，计算中间和四周5个视野，取平均值。[0392]结果分析：采用Transwell实验检测索拉非尼核心靶标分子BCL2对Huh7细胞迁移的影响，结果发现下调BCL2同时加入索拉非尼处理，其肝癌细胞Huh7的迁移受到明显抑制(如图7所示)。该结果说明药物靶标分子筛选PCR试剂对于索拉非尼核心靶标分子的筛选十分有效，有利于研究肿瘤药物靶标及靶标功能分子的开发(结果如图7所示)。[0393]十一、采用裸鼠成瘤实验检测[0394]1、细胞状态是裸鼠成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，Huh7细胞达80-90％左右密度为宜；将各组细胞进行shRNA转染24小时后使用。收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。[0395]2、胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中的血清。[0396]3、用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为2×106个细胞/只，接种体积为0.1ml。[0397]4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。[0398]5、选择的裸鼠一般在6周龄，体重18-20g左右，种植部位选择血供丰富区域为腋窝中后部。[0399]6、接种前用将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率。[0400]7、分组：Huh7细胞组、Huh7细胞索拉非尼灌胃处理组，Huh7转染sh-BCL2组、Huh7转染sh-BCL2组并索拉非尼灌胃处理组(每组6只)。[0401]8、取出裸鼠用鼠笼，顺序摆放在超净台中。选体形较大的小鼠称重，以0.3％的戊巴比妥钠溶液剂量，按照0.1ml/10g腹腔注射麻醉小鼠。约5分钟，小鼠开始进入安静状态，将其俯卧固定。[0402]9、接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。[0403]10、所有细胞注射完毕，剪耳标记，记录剪耳标记及分组情况。[0404]11、注意小鼠的状态，及时发现小鼠是否有因手术刺激、感染等死亡的情况。[0405]12、接种后的第五天开始进行索拉非尼灌胃治疗，一共持续5天，每天均灌胃索拉非尼，第24天，麻醉小鼠，然后颈椎离断，处死小鼠，解剖尸体，观察肿瘤生长状况，肝脏、肺

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脏及其他器官是否有转移瘤形成。

[0406]通过敲低裸鼠移植瘤内BCL2的表达，可以看到移植瘤的生长情况，如图8所示，BCL2敲减的分组肿瘤并进行索拉非尼治疗后，其肿瘤的生长受到了抑制，其肿瘤质量明显小于对照组。该结果进一步证实了通过对肿瘤药物靶标的筛选，可以明显抑制肿瘤的生长。[0407]本发明所述肿瘤药物靶标PCR检测试剂不光在体外(细胞中)的检测有效，其在体内(裸鼠成瘤实验)中的检测亦明显有效果，体现了检测试剂的稳定性与可靠性。

[0408]本发明将涉及与肿瘤药物靶标核心分子密切相关的基因集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨肿瘤药物靶标核心分子在肿瘤细胞中的可能途径，为研究关键蛋白的提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到肿瘤药物靶标核心分子，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。

[0409]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

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序列表<110> 青岛大学附属医院<120> 一种检测肿瘤药物靶标的PCR试剂及其应用<160> 178<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1tactcattca gctcgtcttg t <210> 2<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2agggattagg gtcgtgga <210> 3<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3tcatcgaacg caccttcca <210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4gcttcaggta ctcaaactcg <210> 5<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5gtgcagagat tgtctcgg <210> 6<211> 18<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6cccggccata gtcattgt 18<210> 7<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7cacagcccac atcagctat 19<210> 8<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8gtgcctgggt gattacag <210> 9<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9gggtggtcag tacatgct <210> 10<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10gcatccgacc ttcaatcatt t <210> 11<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11agaagagctg cacatttgac <210> 12<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12cttgagccct aagagcagat t 26

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<210> 13<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13gcgcacagcc acgataata 19<210> 14<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 14gcggcaagta gtccagt <210> 15<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 15gtggggtcat gtgtgtg <210> 16<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 16ggttcaggta ctcagtcatc <210> 17<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 17ggaccaccgc atctctaca <210> 18<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 18agtctggctc gttctcagt <210> 19<211> 21<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 19tcctcttttt acaccccagt c 21<210> 20<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 20cggttgtcaa ggtttgtagt t 21<210> 21<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 21gatgtgctta tgcaggattc <210> 22<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 22atgtactgac caggagggat a <210> 23<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 23tacctcccct ggatgaaga <210> 24<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 24gaaatccgct tgttagggt <210> 25<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 25tggtgtttga gcatgtagac 28

2021191920

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<210> 26<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 26atccttgatc gtttcggct 19<210> 27<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 27ttttcccggc aatgatgtc <210> 28<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 28cagcttggtc atagaggg <210> 29<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 29gtatggtgta ggtgtggac <210> 30<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 30gcaaaggtat tccagggaaa <210> 31<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 31gccagttcag ttacctcg <210> 32<211> 19<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 32tgtgcaacac ccagttagc 19<210> 33<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 33taaccgctgc aagggtagt 19<210> 34<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 34tgaccaaaac attgctcaac a <210> 35<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 35gagttatgtt taccgaggac c <210> 36<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 36atgcagatcc ggtcagag <210> 37<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 37ttcagggcga gtacatgatc <210> 38<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 38gacaccttga gcgtgta 30

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<210> 39<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 39accggctttg tggacat 17<210> 40<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 40tgacctgcat caatagcaac <210> 41<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 41gtagatgcgc gtcatcctt <210> 42<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 42caaccacaag tacaccatga <210> 43<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 43tgccgcaaag tgtgtaac <210> 44<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 44tcacccctaa atgccacc <210> 45<211> 18<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 45ggcctgtgcc cactataa 18<210> 46<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 46ggagaggtca ggtttcaca 19<210> 47<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 47acccaggtct acgatggga <210> 48<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 48tgagctgagt caagcgga <210> 49<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 49cagatgctac ggaccttac <210> 50<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 50acactgagta acacatgctc <210> 51<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 51aaaggtggga tacgaaaaga c 32

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<210> 52<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 52ctgttcttct tagagcgttt g 21<210> 53<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 53tcaaagaggg atgctcactt <210> 54<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 54cttcacacga ccagactc <210> 55<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 55ctcagtgcag ccctagaga <210> 56<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 56aacacgttca cacaaggg <210> 57<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 57aaaacgcata atctgggaca g <210> 58<211> 18<212> DNA

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序　列　表

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 58cgtggtgtgc ttatttgg 18<210> 59<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 59tccgaggagc tactagagg 19<210> 60<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 60gcgcagatgc tcgtactt <210> 61<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 61ttcctgcggg acatagaac <210> 62<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 62gtgacataat tgcggggaaa <210> 63<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 63atctacacca actatgaggc <210> <211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> gcagggtctc aaaaggctt 34

1819202019

CN 111690751 A

序　列　表

11/28页

<210> 65<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 65gccctcacaa agccaat 17<210> 66<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 66tgcttgctgt actccgac <210> 67<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 67ggtgcccatc cttatggt <210> 68<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 68agcggtgtgt ctgagttc <210> 69<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 69agctgtgaag ttaaaccgac <210> 70<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 70ccgtcattac acgatctgtt <210> 71<211> 20<212> DNA

1818182020CN 111690751 A

序　列　表

12/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 71ctggcttctg ctatgtcaac 20<210> 72<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 72ccggtcagtg aggtagaaa 19<210> 73<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 73gcgtccgttg gatgtca <210> 74<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 74cttctcgtgc cacaagtc <210> 75<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 75ccccagtgtc ctctatttct <210> 76<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 76ctggttccaa ggcacattg <210> 77<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 77gcccagtcct taatgacca 36

1718201919

CN 111690751 A

序　列　表

13/28页

<210> 78<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 78acctggacgt gagttttga 19<210> 79<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 79cgctggtccc ggtttatat <210> 80<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 80actggcccgt ttgggga <210> 81<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 81accacaggac agtacagga <210> 82<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 82gtgctgaata ataccactca c <210> 83<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 83agatcaaacg ggtgaagga <210> 84<211> 17<212> DNA

1917192119CN 111690751 A

序　列　表

14/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 84cctgccgaga ttccaca 17<210> 85<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 85cttgaccaat gactgggaa 19<210> 86<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 86gctcctcaca gttatccatg <210> 87<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 87cagtttggtg tcggtttcta <210> 88<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 88tgggtatcgt tgttgtgttt t <210> <211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> ctcttcagtt cgtgtgtgg <210> 90<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 90cctccttaga tcacagctc 38

2020211919

CN 111690751 A

序　列　表

15/28页

<210> 91<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 91tgctgacctc tgttacctc 19<210> 92<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 92gcttattccc cacaatgtag t <210> 93<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 93tggcatcgtt gaggagt <210> 94<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 94acgtccctct cggactt <210> 95<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 95gtcagtgcaa ggtgttctg <210> 96<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 96ttgcggtcag gccattc <210> 97<211> 19<212> DNA

2117171917CN 111690751 A

序　列　表

16/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 97acgtgtcact ttgtgcaag 19<210> 98<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 98tccatgagac ggactcaga 19<210> 99<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 99cttgaggttt attcctgacc c <210> 100<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 100cagacagagc cgatggta <210> 101<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 101agtacagtgc aatgaggga <210> 102<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 102ctgagcctgt tttgtgtcta <210> 103<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 103gcaggggaga gtgatacag 40

2118192019

CN 111690751 A

序　列　表

17/28页

<210> 104<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 104aagccaattc tcacgaagg 19<210> 105<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 105tttgatccct gcaactcagt <210> 106<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 106tctcgtggtc ttttctcaca <210> 107<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 107cagatttgcc aactatcttc g <210> 108<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 108agcggtaaaa gtgtcccct <210> 109<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 109gtgcggctca tgtttaca <210> 110<211> 18<212> DNA

2020211918CN 111690751 A

序　列　表

18/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 110atggcgtctg ataccacg 18<210> 111<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 111agggagcaga ttaagcgag 19<210> 112<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 112ggcttgtttt gtatcaactg t <210> 113<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 113tgtgactcgc actgcaaa <210> 114<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 114ctgcaccgca tagtcctt <210> 115<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 115ctgagcttcg gtgggatg <210> 116<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 116tggcatactc tgctgcaaa 42

2118181819

CN 111690751 A

序　列　表

19/28页

<210> 117<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 117gcacaaatca aggcaggtt 19<210> 118<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 118agtcatgcgg aatcctggt <210> 119<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 119tgtgaggccc ttgttgca <210> 120<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 120acgatcttcc actactttgg <210> 121<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 121tgaaggcagg cacatttac <210> 122<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 122cgacaaggta taatggcaga a <210> 123<211> 21<212> DNA

1918201921CN 111690751 A

序　列　表

20/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 123gatgccgagg aactattcat c 21<210> 124<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 124ttcttctcgt gcagtgtca 19<210> 125<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 125ccagcatgtc gccttagaa <210> 126<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 126gtgctctcac aactctgact <210> 127<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 127gtgtcaaaat ctggcccga <210> 128<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 128gtgtctcgtc atggcttc <210> 129<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 129tctggcctaa tgtagaagca 44

1920191820

CN 111690751 A

序　列　表

21/28页

<210> 130<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 130gcaagacggc tcatctga 18<210> 131<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 131gtaggcaacc gtgaagaaaa <210> 132<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 132aggtgaattg aggtccctaa g <210> 133<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 133ctgcaccgaa accgagtta <210> 134<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 134cgtcatattc gactttggtt g <210> 135<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 135cgtcggtgtc cttttcaac <210> 136<211> 19<212> DNA

2021192119CN 111690751 A

序　列　表

22/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 136tccaccatcc atgaggttc 19<210> 137<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 137cctgaggcgg atgtatg 17<210> 138<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 138tcagccgtct caaaggga <210> 139<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 139tctcgatacc ttcgtagagc t <210> 140<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 140tgagtgacat cgttccattg <210> 141<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 141tgtcacagta cgagatgcaa a <210> 142<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 142ctttcattct tgggatcagg a 46

1821202121

CN 111690751 A

序　列　表

23/28页

<210> 143<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 143gattgggatt tgaccagca 19<210> 144<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 144ggcacaggca cattgaag <210> 145<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 145acgctgccat ccacaagaa <210> 146<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 146ttaatccctg cttcaccagt <210> 147<211> 18<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 147cgggtgaagc ccctaaag <210> 148<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 148gctgccgaag ataggtg <210> 149<211> 21<212> DNA

1819201817CN 111690751 A

序　列　表

24/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 149tgctgactat ggctacaaaa g 21<210> 150<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 150cgggcaatca tcaggca 17<210> 151<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 151attggcgctt ttgggtaca <210> 152<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 152gcagctctcg tagccattt <210> 153<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 153tccccgagaa gtgggtc <210> 154<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 154gaggtagtcg taggcttgg <210> 155<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 155cgattgtgaa catggactac 48

1919171920

CN 111690751 A

序　列　表

25/28页

<210> 156<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 156acgctgaaca gtgcctt 17<210> 157<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 157ggatctctgg cagtttactc <210> 158<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 158caatctctcc ctaagctcc <210> 159<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 159ggctgtggta ttgtagaaag <210> 160<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 160tggcatcatc gagtttggg <210> 161<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 161gttcgtgtag aggggtcaa <210> 162<211> 19<212> DNA

2019201919CN 111690751 A

序　列　表

26/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 162ccgtccacct tttgtagtt 19<210> 163<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 163cagctttgag gtgcgtgtt 19<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1cctttcttgc ggagattctc <210> 165<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 165tgaagcagat cgagagcaa <210> 166<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 166gtggctgaga agtcaactac t <210> 167<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 167tgggcaattt attggtcctc a <210> 168<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 168ccaagtaacg tggtctttca 50

2019212120

CN 111690751 A

序　列　表

27/28页

<210> 169<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 169atgtacgttg ctatccagg 19<210> 170<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 170tccttaatgt cacgcacga <210> 171<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 171aggctatcca gcgtactcc <210> 172<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 172ggcaggcata ctcatcttt <210> 173<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 173tgggctacac tgagcac <210> 174<211> 17<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 174tgggctacac tgagcac <210> 175<211> 19<212> DNA

1919191717CN 111690751 A

序　列　表

28/28页

<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 175aaaaggaccc cacgaagtg 19<210> 176<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 176gtcaagggca tatcctacaa ca 22<210> 177<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 177agattggcta cccaactgt <210> 178<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 178gaaggtgtaa tccgtctcca 52

1920

CN 111690751 A

说　明　书　附　图

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图1

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图3

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说　明　书　附　图

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图4

图5

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说　明　书　附　图

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图6

图7

图8

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