维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．２（总７０） ＨＰＣＥ／ＨＰＣＥ—ＭＳ技术厦舆在仓品分析中的应用 顾宗珠 （广东轻工职业技术学院摘要 高效毛细管电泳技术（舳）及其与质谱联用技术（舳５１０３００） 一ＭＳ）是近年来发展较快的分析技术，本文介绍了高效毛 细管电泳技术的原理及其与质谱联用的关键技术，并对该技术的国内外研究成果和在食品分析中的应用进行了综述。 关键词高效毛细管质谱ＨＰＣＥ—ＭＳ联用技术食品分析 Ａｂｓｔｒａｃｔ ＨＰＣＥ ａｎｄ ＨＰＣＥ—ＭＳ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｓｔ ｆｅｗ ｙｅａｒ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ＨＰＣＥ ａｎｄ ｔｈｅ ｋｅｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ＨＰＣＥ—ＭＳ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｆｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ ａｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｈｉ曲Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｍｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｍｍ；ＨＦＬ￣一ＭＳ；Ｆｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ 毛细管电泳（ＣＥ）是经典电泳技术和现代微柱技 术的结合产物，高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）作为新的色 谱技术之一发展非常迅速，这是目前任何分析技术所 难以比拟的。由于ＨＰＣＥ具有远快于ＨＰＬＣ和一般电 ＣＺＥ是ＣＥ中最简单、最基本的模式。在这种模 式的分离中，毛细管中仅填充电解质缓冲溶液，分离 基于溶质因荷质比的差异所引起的迁移率的不同。 其应用范围包括氨基酸、肽和蛋白质、对映体、有机 酸、小离子及维生素等。 泳的分析速度（５～３０ｍｉｎ）、分离度高（理论板数最高 可达１×１０７／ｍ）、检测灵敏度高（一般为１０ １０— １．２．２胶束电动毛细管色谱（ＭｅＩ（Ｃ或ＭＥＣＣ） 该法是在ＣＥ所用的缓冲溶液中加入表面活性剂 胶束，溶质根据其在胶束相和水相的分配系数的不同 而进行分离。ＭＥＫＣ是唯一的一种既能分离带电组 分又能分离中性溶质的模式。主要用于小分子、手性 ｍｏｌ／Ｌ）、进样量少（１～１０ｎＬ）、再现性佳、能直接进样 及易于自动化操作，且几乎可以与各种检测器（如 ＭＳ）联用、适用范围广等优点，作为一种极其重要的 分离分析方法，成为近２０年来发展最快的一种技术。 ＨＰＣＥ已引起生命科学、食品科学等各领域的极大重 化合物以及药物等的分离。３毛细管凝胶电泳（ＣＧＥ） 视，并广泛应用在系列化分析、临床医学、环保、食品、 １．２．化学等领域，应用于生物大分子等领域的分离及有机 小分子和无机离子的分析中。 １ ＨＰＣＥ技术 １．１ ＣＥ的工作原理 ＣＧＥ是将凝胶移到毛细管中作支持物，凝胶起 “分子筛”的作用。溶质根据其体积大小不同而分离。 常用于蛋白质，寡聚核苷酸以及ＤＮＡ、ＲＮＡ等大分子 的分离。 １．２．４毛细管等电聚集（ＣＩＥＦ） ＨＰＣＥ是使毛细管柱内的不同带电粒子（离子、分 子或衍生物）在高压电场作用下，以不同的速度在电 泳介质中定向迁移，从而进行分离。 １．２ ＣＥ的模式 ＣＩＥＦ是基于物质的等电点不同而进行的分离。 用于测定蛋白质的等电点、分离异构体和用其它方法 难于分离的蛋白质。 １．２．５毛细管等速电泳（Ｃ１ＴＰ） 根据样品组分在电泳介质中所受作用力的不同， ＣＥ可分为以下六种模式： １．２．１ 毛细管区带电泳（Ｃ ） 收稿日期：２ｏｏ２—３一ｌＯ Ｃ１ＴＰ是在缓冲溶液中使用前导电解质和后继电 解质，溶质按其电泳淌度不同而分离。 １．２．６毛细管电色谱（ＣＩ ） ＣＥＣ是将ＨＰＬＣ中的固定相填充到毛细管中，以 电渗流为驱动力，溶质根据其与固定相相互作用的不 同而分离。 ４７ 作者简介：顾宗珠。广东轻工职业技术学院食品生物工程系食品检验教 研室主任 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技》 Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．２（总７０） 在食品分析应用最广泛的是ＣＺＥ和ＭＥＫＣ。 ２毛细管电泳在食品分析中的应用 毛细管电泳在食品分析中的应用主要包括蛋白 质、糖类、维生素、矿物质、有机酸、食品添加剂、农药 残留量、生物毒素、抗生素残留量和食品中其它一些 物质的测定。 阴离子的应用有蔬菜及饮用水中Ｃ１一、ｓｏ４ 、ＮＯ３一、 Ｆ一的测定等。 矿物质是用｝Ⅱ℃Ｅ测定最多的一部分。测定的 目标有钾、钠、钙、镁、锰、硒和锰、氯化钾、氟化物、碳 酸盐、盐和亚盐、硫酸盐等。在食品中的分 析有各种饮料、食醋、饼干、花生、蔬菜、茶叶、矿泉水、 饮用水、牛奶、奶粉等。 ２．１蛋白质、氨基酸和多肽的分析 ｝Ⅱ℃Ｅ用于食品中蛋白质的分离已有很多报道， 如通过测定葡萄酒在生产过程中蛋白质的变化来研 ２．５有机化合物的测定 对可电离的有机化合物可直接采用ＣＺＥ模式分 究提高葡萄酒的质量、测定超高温牛乳贮藏中蛋白质 的变化、肉样种类的鉴别、还可根据电泳图的特有性 质判断乳的种类或是否掺假。 目前，氨基酸的分析在食品行业及保健品行业中 已占有很重要的地位。 国外的食品分析专家早在２Ｏ世纪９ｏ年代初就利 用鳓技术从豚鼠和鱼的组织中分离出了肉类主 要呈鲜物质——核苷酸。核苷酸是ＤＮＡ的降解产 物，依据动物性食品中核苷酸含量的多少，就可以判 断其新鲜程度。因此，分析核苷酸已成为生物化学、 医疗、卫生防疫和卫生检疫的重要内容，同时，核苷酸 的分离也是各食品公司开发及研究风味食品过程中 必不可少的一项关键技术。 ２．２维生素和黄酮类化合物的分析 由于传统的ＨＰＬＣ进行维生素的分离效果不佳。 因此，鳓技术在维生素的分析应用方面正逐步成 为食品行业的一种普及方法。用｝Ⅱ℃Ｅ测定速度快、 成本低，可在ｌ５分钟内同时测定多种水溶性维生素 药品中维生素Ｂ１、维生素Ｂ２、维生素Ｂ６、维生素Ｂ１２、 维生素Ｃ、烟酸、乳清酸、泛酸、烟酰胺，并有很好的重 复性。 黄酮类化合物普遍存在于植物性食品中，通过 鳓技术可快速测定几个黄酮类组分可评价柠檬汁 纯度。 ２．３糖类的分析 过去常用ＨＰＬＣ和ＧＣ等方法来测定葡萄糖，近 年来｝Ⅱ℃Ｅ在单糖及山梨酸的分析方面显示出其独 特的优越性。 ２．４无机离子的分析 ＨＰＣＥ分离无机阴离子的关键是在电解质溶液中 加入电渗流改性剂，使电渗流的方向与阴离子的电泳 方向相同，负极进样，正极检测。目前用鳓分析 ４８ 析，而对非电离物质及电离物质和非电离物质的同时 分析，一般需要加入合适的分配相，采用ＭＥＫＣ模式 分析，ＨＰＣＥ测定食品中的有机化合物种类很多，如 啤酒、葡萄酒、果汁、土豆汁、蔬菜、酸奶、面包等的柠 檬酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、草酸、醋酸；食品中添 加剂，如防腐剂（山梨酸、苯甲酸）、甜味剂（甜蜜素、甜 味素）、抗氧化剂、咖啡因、人工合成色素、谷物中的杀 虫剂、植物生长调节剂、红酒中的酚类化合物、奶油中 的脂肪酸分析等；还能迅速分析一些基质复杂的试 样。如鱼中组胺、大豆中植酸、海产品中麻痹性贝类 毒素；还可通过测定鱼类核苷酸降解产物评价鱼的新 鲜度；进行玉米粉中ＡＦＴ的分离等。此外，还有农药 残留量的测定，如小麦、大麦、大豆和玉米中的除草 剂，有机磷农药；玉米中的霉菌毒素，如黄曲霉毒素 Ｂ ；动物组织中的抗生素的残留量，如磺胺类抗生素、 牛奶中的氯霉素、抗菌兽药乙胺嘧啶等。 作为一种高效分离技术，鳓在食品分析中的 应用已显示出巨大的潜力。所分离检测的食品有动 物性食品，也有植物性食品，有固态的，也有流体的。 分析的组分几乎包含了除脂肪外的全部种类（营养物 质、有害组分、特殊成分）。可用于食品生产过程中的 质量检测、品质评价、食品科学研究以及质量监测。 因此，在１９９７年３月在美国亚特兰大第４８届分析化 学与应用光谱学匹兹堡国际会议上，鳓被列为在 食品分析、饮食安全检测等方面重点发展的内容之 一。可以预计，随着对鳓研究的深入和ＨＰＣＥ仪 器的逐渐普及，ＨＰＣＥ与高灵敏度检测器的联用（如 鳓一ＭＳ，鳓一 ），鳓技术必将成为食品分 析的一项普及方法，将在食品分析中发挥更大的作 用。 ３ ＨＰＣＥ—ＭＳ技术 色谱法最初仅仅是作为一种分离手段，直到２０ 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技＞ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ１．１８ Ｎｏ．２（总７０） 世纪五十年代，人们才开始把这种分离手段与检测系 统连接起来，而成为一种独特的分析方法，是几十年 来分析化学中最富活力的领域之一，也是生命科学和 制备化学中广泛应用的一种手段。由于一般毛细管 ＨＰＣＥ—ＭＳ联机的关键是如何将毛细管电泳的流出 物，以在线的方式有效地传人到质谱仪而不丢失分离 效率，也就是说要设计一种接口用以完成这项任务。 ３．１ ＨＰＣＥ—ＭＳ仪器接口 目前成功地应用到ＣＥ—ＭＳ接口中的离子化技 的内径小于１００￣ｍ，进样量小（通常在ｎｌ级），导致检 测光程变短，检测灵敏度较低，所以对ＣＥ的检测器的 术有连续流快原子轰击（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ—ｆｌｏｗ ＦＡＢ，ＣＦ— ＦＡＢ），离子喷雾（Ｉｏｎｓｐｒａｙ，ＩＳＰ），电喷雾（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ， ＥＳＩ），大气压化学电离（ＡＰ—ＣＩ），基体辅助激光解吸 离子化（Ｍａｔｒｉｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎ ｉｚａｔｉｏｎ． ＭＡＬＤＩ）和等离子体解吸（Ｐｌｓｍ ａ Ｄｅｓｏｒａｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａ— 要求非常高。作为色谱的检测器，应能满足灵敏度 高、重新性好、响应快、线性范围宽、适应范围广、对流 动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。目 前，有紫外一可见光度检测器，拉曼光谱检测器，荧光 检测器，化学荧光检测器，质谱检测器，电化学检测 器，核磁共振检测器以及光电二极管阵列检测器等 等，各种各样检测器的研究仍层出不穷。而一般商品 化仪器所配备的紫外检测器检测灵敏度仅为１０～～ １０～ｍｏｌ／Ｌ，远不能满足痕量、超痕量物质分析的要 求。 毛细管电泳（ＣＥ）可以快速、高效地分离复杂混合 物，但无法用于未知样品的定性分析。而质谱（ＭＳ） 具有较强的定性功能，在一次分析中可获得很多结构 信息，能提供组分的分子量和结构信息，但不能分离 组分。将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法 学中的一项突破性进展。ＨＰＣＥ—ＭＳ在一次分析中 可同时得到迁移时间、分子量和碎片特征信息，为复 杂样品的定性、定量分析提供了一种强有力的手段。 在ＨＰＣＥ的所有检测器中，质谱（ＭＳ）是唯一能提供分 析物结构和分子量信息的检测器。 质谱作为一种分析方法，长期以来一直用于小分 子物的结构分析，直到８０年代末电喷雾电离质谱（ＥＳＩ —ＭＳ）和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱（ＭＡＬ— ＤＩ—ＴＯＦ—ＭＷ）两种“软电离”质谱的出现，才将质谱 的分析范围扩大到生物大分子的结构分析。自１９８７ 年首次报道了毛细管电泳与质谱的联用技术之后它 在生命分析化学领域中显示了巨大的应用前景，用质 谱法作气相色谱（ＧＣ）的检测器已成为一项标准化ＧＣ 技术被广泛使用，但由于ＧＣ—ＭＳ不能分离热不稳定 和不挥发性物质，所以发展了液相色谱（ＬＣ）与质谱法 的联用技术。以后根据 的模式又相继发展了ＣＧＥ （毛细管凝胶电泳）一ＭＳ，ＣＩＥＦ（毛细管等电聚焦）一 ＭＳ，ＭＥＫＣ（胶束电动毛细管色谱）一ＭＳ和ＣＥＣ（毛细 管电色谱）一ＭＳ等技术。 最早的ＨＰＣＥ与ＭＳ联用是脱机方式，最近的 嗍一ＭＳ装置大都是联机方式，与ＬＣ—ＭＳ一样， ｔｉｏｎ，ＰＤ）离子化技术等，其中ＭＡＬＤＩ和ＰＤ以脱机方 式联用，ＣＥ和ＭＳ均是现成的技术，接口是关键。 ３．２与ＭＳ联用的毛细管电泳技术 ３．２．１ ＣＺＥ—ＭＳ法 ＣＺＥ—ＭＳ法是最简单和最成熟的常用方法，已 广泛用于生物大分子和药物代谢产物等小分子的分 析中，由于受质谱技术的，ＣＥ流出物不得含有高 盐物和表面活性剂成分，最好是易挥发性缓冲液，所 以ＣＥ—ＭＳ早期是采用毛细管区带电泳法，使用的缓 冲液主要有甲酸、乙酸的铵盐等挥发性物质，采用非 水缓冲液分析水不溶性有机物是发展ＣＺＥ的方向。 ３．２．２ Ｃ砸Ｆ—ＭＳ 是将毛细管等电聚焦（ＣＩＥＦ）与ＭＳ联用，给复杂 生物大分子混合物的分离和结构阐述提供了一种强 有力的工具。将ＣＩＥＦ与ＭＳ在线连接，操作上存在困 难，通过对同轴包层液ＥＳＩ接口的改进，实现厂ＣＩＥＦ 与ＭＳ的联用，获得了高分辩率和高灵敏度的检测结 果。ＣＩＥＦ—ＭＳ是最近出现的技术，到目前为止还未 得到广泛应用。 ３．２．３ ＣＧＥ—ＭＳ法 用液体连接离子喷雾接口，将凝胶毛细管电泳 （ＣＧＥ）技术与质谱仪相连接，在凝胶中完成的分离缓 冲液和相对高浓度的尿素不会流出ＣＥ柱，而不会对 质谱仪带来影响。 ３．２．４ Ｍ匣ＫＣ—ＭＳ法 是ＦＡＢ—ＭＳ与ＭＥＫＣ联用技术，但因胶束产生 高的背景，而使这一方法在实际应用中受到。可 用以下方法克服ＭＥＫＣ中缓训液存在较高的表面活 性剂浓度，不能进行电喷雾的缺限：采用高分子量低 浓度的表面活性剂；采用表面活性剂的部分填充法； 采用ＡＰＣＩ接口；采用半透膜的方法，将ＭＥＫＣ与ＭＳ 联用。 ４９ 维普资讯 http://www.cqvip.com 《广州食品工业科技＞ ３．２．５ ＣＩＴＰ—ＭＳ法 ￣ｏ１．１８ Ｎｏ．２（总７Ｏ） 响，因此ＣＥ与ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦＭＳ在线联用难度较大。 因此ＣＥ与ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ在线联用技术的研究成 果较少。美国Ｉｏｗａ，ｋｌ、Ｉ立大学杨士诚教授等最近设计 了一种新型、简单的连续液流ＣＥ与ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ 在线联用接ＶＩ。利用该接ＶＩ技术，成功地克服了因 ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦＭＳ内的高真空引起的ＣＥ的层流及扰 将ＣＩＴＰ与ＭＳ法直接相联用的很少，大部分含有 ＣＩＴＰ的ＣＥ—ＭＳ是用Ｃ１ＴＰ作为ＣＥ—ＭＳ分离前的浓 缩技术。 ３．３与ＨＰＣＥ相联用的ＭＳ技术 最早的ＣＥ—ＭＳ联用是采用单级四极质谱仪，以 后发展到三级四极质谱、四极离子阱质谱、傅里叶变 换离子回旋共振质谱法（ＦＴＩＣＲ—ＭＳ）飞行时间质谱、 动，使ＣＥ流速处于正常水平（２～３ｎｌ／ｓ），从而减少ＣＥ 分离效率降低的可能性。 ３．４ ＣＥ—ＭＳ的应用 电感耦合等离子体质谱法（ＩＣＰ—ＭＳ）、磁质谱（Ｍａｇ— ｎｅｔｉｃ Ｓｅｃｔｏｒ—ＭＳ）ｏ １９９５年，Ｃａｉ等对ＣＥ与四极滤质、离子阱和傅利 叶变换离子回旋共振ＭＳ联用技术进行了评述，指出 这些质量分析器在获得一张完整质谱图需要较长的 时间（０．１～２秒），对ＣＥ馏分无法作出快速响应。而 飞行时间质谱（ＴＯＦＭＳ）完成同样的任务仅需０．１～０． ２微秒，同时还具有分析质量范围宽、离子传送效率 高、灵敏度高和高效能循环（ｍｇｈ ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）等优点， 使其成为ＣＥ检测器的最佳选择。目前多采用电喷雾 （ＥＳ）和连续流体快原子轰击（ＣＦＦＡＢ）作为ＣＥ和 ＴＯＦＭＳ的接口，这两种接口容易实现在线联接。尽 管ＥＳ电离具有高电离效率、软电离、产生多电荷等优 点，但是对于未知的混合物，每一个分析物质多重峰 的存在，不仅使数据解析复杂化，而且使检测灵敏度 降低。基体辅助激光解吸／电离（ＭＡ１，１３１）是一种新的 “软电离”技术，特别适于极性大、难挥发、难气化的生 物大分子的电离，ＣＥ—ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ正在成为ＣＥ 技术的前沿课题之一。它使质谱技术在蛋白质结构 分析上的应用发生了性的飞跃。ＨＰＩＸ２和毛细管 电泳与ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦ质谱联机的发展，将使微量蛋白 质的鉴定，转译后修饰和二硫键定位等成为一种快速 的日常操作。 在ＣＥ与ＭＡ１，１３１一ＴＯＦＭＳ离线联用技术中，样品 接收、样品与基体的混合、晶体的形成等步骤都关系 到ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ分析结果的灵敏度和分辨率，而 且整个分析过程费时繁琐。因而人们从一开始就致 力于ＣＥ与ＭＡＩＹ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ在线联用技术的研究与 开发，但是就如何在线获得样品和基体的混合物，以 及该混合物经在线处理后适合ＭＡＩＸ）Ｉ—ＴＯＦＭＳ分析 这个问题一直未得到很好的解决，ＣＥ与ＭＡＩＸ）Ｉ在线 接口既要考虑如何在ＣＥ的馏分中加入ＭＡＩＸ）Ｉ的辅 助基体，又要考虑质谱仪负压对ＣＥ的分离效率的影 ５０ ＭＳ是ＣＥ所有检测器中最复杂和最昂贵的检测 器，不易于普及使用，但ＭＳ可以给出其他ＣＥ检测器 所不能得到的结构信息，这就使之作为ＣＥ检测器的 不足之处得以调和，况且ＭＳ仪的价格也在不断下降。 到目前为止ＣＥ—ＭＳ的联用还不多，ＣＥ—ＭＳ仅需要 极少量的样品，所以其应用重点集中在样品量非常有 限的情况，尤其适用于基因工程产品与蛋白质酶消化 物的定性分析。如：酶解产物、蛋白质的多肽、核苷 酸、药物及其代谢产物的分析。ＣＥ—ＭＳ法还可用于 食品分析中，如农用化学物质，杀虫剂、无机化合物的 测定。如用ＣＩＴＰ—ＣＺＥ—ＥＳＩ—ＭＳ法测定扇贝组织 中的麻痹贝类毒素。 近年来，ｍ℃Ｅ的发展展示了其在药物、多肽、酶、 抗原、抗体、核酸、ＲＮＡ的分离和ＤＮＡ测序方面有着 巨大潜力。 ＨＰＣＥ—ＭＳ的应用报道虽然很多，但作为常规方 法尚存在以下缺点：浓度灵敏度低，不如ＬＣ—ＭＳ；不 是所有的ＣＥ分离模式都可方便地用于与ＭＳ相联 用；ＭＳ对ＣＥ分离缓冲液的较多。因此，ＨＰＣＥ— ＭＳ技术还有待进一步的发展。 参考文献 １王继贵．毛细管电泳．当代医师杂志．１９９７．１０． ２梁．世纪之交的蛋白质序列测定技术，生命科学．１９９９ １． ３周国华等．毛细管电泳质谱联用技术测定肽和蛋白质混合 物．高等学校化学学报．１９９８．３． ４王红霞等．蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱研究进展，药 学学报．２００１．４． ５周国华等．毛细管电泳质谱联用技术及其应用，分析科学学 报．１９９８．１０． ６袁倬斌等．毛细管电泳和基体辅助激光解吸／电离飞行时间 质谱联用技术研究进展． ７杨永坛等．毛细管电泳中的样品浓缩技术，色谱，２０００．３．
