第２５卷第１１期 化学研究与应用 Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．１１ ２０１３年１１月 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｖ．，２０１３ 文章编号：１ｏ０４—１６５６（２０１３）１１－１５５０－０４ 乙Ｕ ２＋ 、Ｐｂ２＋ 和Ｎｉ２＋对日落黄与牛血清 白蛋白作用的影响研究 李建晴 ，张爱花，蔡雪梅 （晋中学院化学化工学院，陕西晋中０３０６００） 摘要：利用荧光光谱法，在ｃｕ 、Ｐｂ 和Ｍ 存在时，不同温度下食用合成色素日落黄（ＦＣＦ）对牛血清白蛋白 （ＢＳＡ）的内源荧光猝灭的特性进行了研究。测定了三个温度下的猝灭常数Ｋ ，结合常数Ｋ ，结合位点数ｎ。 经过比较发现，有无金属离子，ＦＣＦ对ＢＳＡ荧光猝灭机理基本一致。Ｃｕ“和Ｎｉ 离子虽然也有与ＢＳＡ结合的 倾向，但总的趋势是加强了ＦＣＦ与ＢＳＡ的相互作用。Ｐｂ 则不同，不同程度地减弱了ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合作 用，可能与Ｐｂ 结合蛋白质能力更强有关。 关键词：日落黄；牛血清白蛋白；荧光光谱法；Ｃｕ ；Ｎｉ“；Ｐｂ 中图分类号：０６５７．３ 文献标志码：Ａ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｕ（Ｈ），Ｎｉ（Ｈ）ａｎｄ Ｐｂ（Ｈ） ＬＩ Ｊｉａｎ—ｑｉｎｇ ，ＺＨＡＮＧ Ａｉ—ｈｕａ，ＣＡＩ Ｘｕｅ—ｍｅｉ （Ｊｉｎｇｚｈｏｎｇ ＣｏＨｅｇｅ，Ｊｉｎｇｚｈｏｎｇ ０３０６００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ａｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｌｆｕｏ— ｒｅｓｅｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆＣｕ（ＩＩ），Ｐｂ（ＩＩ），ａｎｄ Ｎｉ（ＩＩ）．Ｔｈｅ ｑｕｅｎｃｈ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ Ｋｓｖ（ＩＪｍｏ１），ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ＫＡ（Ｌ／ｍｏ１） ａｎｄ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｎ ａｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｅｉｔｈｅｒ．Ａｆｔｅｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ＦＣＦ ｉｓ ｂａｓｉｃａｌｌｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｗｉｔｈ ＢＳＡ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｒｅ ｉｓ Ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｏｒ ｎｏｔ．Ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｕ（ＩＩ）ａｎｄ Ｎｉ（ＩＩ）ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｔｅｎｄｅｎｃｙ ｔｏ ｃｏｍｂｉｎｅ ｗｉｔｈ ＢＳＡ，ｉｔ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｓｔｒｅｎ￣ｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｂ“ ｗｅａｋｅｎｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗ ａｎｄ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｔｏ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｅｇｒｅｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｒｅｌａｔｅ ｔｏ Ｓｔｒｏｎ— ｇｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｏｒｃｅ ｂ￣ｔｗｅｅｎ Ｐｂ“ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）；ｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｃｕ ；Ｎｉ２￣；Ｐｂ 血浆中含量丰富的载体蛋白，血清白蛋白，生 是人们关注的研究内容…。日落黄 （ｓｕｎｓｅｔ 物体内许多内源性物质及其药物分子通过其发生 ｙｅｌｌｏｗ ＦＣＦ）即１一对苯磺酸偶氮基－２一萘酚－６磺酸二 作用，对体内一些化合物的代谢和分布也有很大 钠盐，分子式为ｃ Ｈ，。Ｎ：Ｎａ：０，Ｓ ，又名晚霞黄、夕 程度的影响，对其相互作用模式的实验研究一直 阳黄、橘黄。属水溶性偶氮类色素，它可用于食 收稿日期：２０１３－０３－２９；修回日期：２０１３－０７－０３ 基金项目：国家自然科学基金项目（２１１７５０８６）资助；山西省高校科技研究开发项目（２０１１１０２６）资助 联系人简介：李建晴（１９６３－），女，教授，主要从事分子光谱分析的研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｑ１９６３＠１２６．ｃｏｍ 第１１期 李建晴，等：ｃｕ２＋、Ｐｂ 和Ｎｉ 对日落黄与牛血清白蛋白作用的影响研究 １５５１ 品、药物及化妆品等的着色，结构如图１。 本文在研究日落黄（ＦＣＦ）对牛血清白蛋白 （ＢＳＡ）的荧光猝灭机制的基础上，对人体中微量 元素Ｃｕ（ＩＩ）及可能的有害金属Ｐｂ（ＩＩ）和Ｎｉ（ＩＩ）对 ＦＣＦ．ＢＳＡ间结合反应的影响，以及与ＦＣＦ—ＢＳＡ竞 争作用进行了实验研究。考察了Ｃｕ（ＩＩ）、Ｐｂ（ＩＩ） ２．１ Ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｐｂ 存在下ＦＣＦ对ＢＳＡ荧光光谱 的影响 ２结果与讨论 在Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｐｂ 的浓度为１．０ｘ１０～ｍｏｌ・Ｌ 和Ｎｉ（ＩＩ）浓度、离子强度等对ＦＣＦ—ＢＳＡ作用的结 合常数，结合位点等的影响。为药物研究、重金属 的体系中，选用中性ｐＨ＝７．４３的条件，研究ＦＣＦ 与ＢＳＡ的作用。固定ＢＳＡ的浓度为１．０ｘ１０ ｔｏｏｌ 元素的中毒与解毒机理研究提供了一些实验基础 和一定的理论依据。 ＳＯ ３Ｈ 图１ 日落黄的结构 Ｆｉｇ．１ Ｓｕｎｓｅｔ ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １ 实验部分 １．１仪器与试剂 ＣＡＲＹ Ｅｃｌｉｐｓｅ荧光分光光度计（自带恒温装 置）（美国ＶＡＲＩＡＮ公司）；ｐＨＳ－２ＳＴ数显酸度计 （上海天达仪器有限公司）； Ｅｌ落黄（天津多福源实业有限公司）：配制 １．ＯｘｌＯ～ｍｏｌ・Ｌ 的储备液。牛血清白蛋白（ＢＳＡ） （上海伯奥生物科技有限公司），配制１．Ｏｘ１０ ｍｏｌ ・Ｌ 的储备溶液；Ｂｒｉｔｔｏｎ—Ｒｏｂｉｓｏｎ缓冲溶液；ＣｕＣ１２、 Ｎｊ（ＮＯ３）２、Ｐｂ（ＮＯ３）２配成１．０ｘ１０～ｔｏｏｌ・Ｌ 的储 备液；使用时适当稀释。实验用水为亚沸二次蒸 馏水，其余药品均为分析纯。 １．２实验方法 １０ｍＬ比色管中依次加入１．０ｍＬＢＳＡ储备液， １．０ｍＬ １．０ｘｌ０～ｔｏｏｌ・Ｌ 的Ｃｕ 或Ｎｉ 或Ｐｂ 储备 液，不同量ＦＣＦ储备液，２．０ｍＬ ｐＨ＝７．４３的Ｂ—Ｒ 缓冲溶液，然后定容，放置３０ｍｉｎ，在Ａ。 ／Ａ。 ＝２８０／ ３４８ｎｍ处，１ｃｍ比色皿，激发和发射狭缝均为５ｎｍ， 扫描荧光光谱。 ・Ｌ～，改变ＦＣＦ的浓度，按实验方法测得Ｃｕ ， Ｎｉ ，Ｐｂ 存在下，不同浓度ＦＣＦ与ＢＳＡ作用的荧 光光谱如图３，４，５所示。与ＦＣＦ对ＢＳＡ荧光猝灭 荧光谱图２对照。Ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｐｂ 的加入对ＦＣＦ 对ＢＳＡ内源性荧光的猝灭现象有所加强，ＢＳＡ的 峰形变化不大，发射峰的位置入 没有显著移动。 金属离子与探针小分子和ＢＳＡ的结合发生了竞争 ， 效应【３．４ Ｊ。 ㈣ 啪 ㈣ 枷 瑚 ０１ ３３０ ３８Ｏ ４３０ （ｎｍ） 图２ ＦＣＦ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱 Ｆｉｇ．２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ ｗｉｔｈ ＦＣＦ ＣＢＳ＾＝１．０￣１０～ｔｏｏｌ・Ｌ～，ＣＦＣＦ＝０，２，４，６，８， ｌ０，１２，１４，１６，１８（ｘｌＯ～ｔｏｏｌ・Ｌ ） （ｎｎ１） 图３ Ｃｕ（ＩＩ）存在下ＦＣＦ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱 Ｆｉｇ．３ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ—ＦＣＦ—Ｃｕ（ＩＩ） ［ＢＳＡ］＝１．０ｘｌ０一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ，［ｃｕ ］＝１．ＯｘｌＯ一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ， ＣＦｃＦ＝０，２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８（ｘｌＯ一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ） １５５２ 化学研究与应用 第２５卷 ＾（Ｂｉｎ） 图５ Ｐｂ（ＩＩ）存在下ＦＣＦ对ＢＳＡ的荧光猝灭光谱 Ｆｉｇ．５ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＢＳＡ・ＦＣＦ—Ｐｂ（Ｉｉ） ［ＢＳＡ］＝１．０ｘｌ０一 ｔｏｏｌ・Ｌ一 ，［Ｐｂ２＋］＝１．０ｘｌ０一 ｍｏ！・Ｌ一 ， ＣＦｃＦ＝Ｏ，２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８（ｘｌＯ—ｔｏｏｌ・Ｌ ） ２．２ Ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｐｂ 存在下ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合常 数 、结合位点数ｎ Ｃｕｎ、Ｎｉ 、Ｐｂ 存在下，对ＢＳＡ荧光猝灭的Ｓｔｅｒｎ． Ｖｏｌｍｅｒ曲线图６。求得三种金属离子存在下，ＦＣＦ 对ＢＳＡ荧光猝灭的猝灭常数 。取蛋白质中色 为进一步确定猝灭类型，测定了１５、２７、３９￣Ｃ 三个温度下ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｐｂ 存在时ＦＣＦ对ＢＳＡ荧 光的猝灭情况。根据Ｓｔｅｒｎ．Ｖｏｌｍｅｒ猝灭方程 ］， Ｆｏ／Ｆ＝１＋ ［Ｑ］＝１＋ｋ Ｔ。［Ｑ］（其中 为猝灭剂 不存在时的荧光强度，Ｆ为加入猝灭剂后的荧光 胺酸分子荧光平均寿命（ 。）＝１０一，而Ｋｓ ＝ｋｑ ７－。， 由此可计算各体系的猝灭过程的速率常数ｋ。【７ Ｊ。 根据ｌｏｇ（（Ｆ０一Ｆ）／Ｆ）＝ｌｏｇ／（ ＋ｎｌｏｇ［Ｑ］，求得不同 温度下Ｃｕ 、Ｎｉ 、Ｐｂ 存在时ＦＣＦ和ＢＳＡ的结合 常数ＫＡ结合位点数ｎ，结果见表１。 、强度，［Ｑｌ为猝灭剂的浓度），做１５℃时ＦＣＦ及 表１ ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合常数 ，结合位点数ｎ和猝灭常数 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ＫＡ，ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｑｕｅｎｃｈ ｃｏｎｓｔｅｎｔｓ ｏｆ ＦＣＦ ａｎｄ ＢＳＡ 从图６和表１的Ｋｓｖ的可见：Ｃｕ２＋、Ｐｂ２＋、Ｎｉ 的 在，减小了ＦＣＦ对ＢＳＡ荧光的猝灭作用。 加入，对ＦＣＦ．ＢＳＡ体系的荧光猝灭类型没有影响， 猝灭过程的速率常数ｋ 大于探针与荧光体作用的 最大扩散常数（２．ＯｘｌＯｍＬ・ｍｏｌ～・Ｓ ） Ｊ。随着温 另外，从表１中可以看到，ｃｕ 、Ｎｉ２＋、Ｐｂ 的存 在，不同温度下对ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合常数影响略 有不同。实验的三个温度下，Ｐｂ 存在时，均使 ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合常数 减小，可能与ｐｂ 结合 蛋白质能力更强有关。Ｎｉ 和Ｃｕ 存在时，ＦＣＦ与 ＢＳＡ的结合常数 在１５。Ｃ和２７℃时增大，３９℃时 度升高ＦＣＦ与ＢＳＡ猝灭曲线的斜率减小，仍然属 静态猝灭【９。 。其猝灭常数Ｋ 的大小为：ＦＣＦ＞ ＦＣＦ＋Ｐｂ ＞ＦＣＦ＋Ｎｉ ＞ＦＣＦ＋Ｃｕ“。金属离子的存 第１１期 李建晴，等：ｃｕ２＋、Ｐｂ 和Ｎｉ 对日落黄与牛血清白蛋白作用的影响研究 ２－Ｏ １５５３ 减小。温度升高时，可能Ｎｉ 和Ｃｕ 与ＢＳＡ结合 能力变强，导致ＦＣＦ与ＢＳＡ的结合能力变弱。 １．８ 总之，Ｃｕｎ、Ｎｉ 离子的存在，虽然也有与ＢＳＡ 结合的倾向，但净的结果是加强了ＦＣＦ与ＢＳＡ的 作用。Ｐｂ 的存在，不同程度上减弱了ＦＣＦ与 ＢＳＡ的结合作用。由于ＢＳＡ可与许多金属离子发 生作用，各种金属离子与ＢＳＡ的结合部位不同，结 合力也有差别。金属离子的存在会影响色素与白 １．２ １・６ 已 １．４ 蛋白的结合能力，即影响色素与血清白蛋白的结 合常数。如果金属离子的存在能使色素与白蛋白 的结合能力增强，会使色素更好的被存储、运载， 这样色素在血浆中储留的时间将延长，可以达到 缓释的目的，减小色素的毒性。同时，通过研究金 属离子存在下染料与蛋白的结合，也有助于理解 金属离子的生理学意义，或金属离子的中毒与解 毒作用。 参考文献： ［１］白海鑫，杨成，杨秀荣．牛血清白蛋白与Ｉｎｄｏ．１相互作 用的荧光光谱法研究［Ｊ］．高等化学学报，２００７，２８ （２）：２２７－２３３． ［２］周家华．食品添加剂［Ｍ］．北京：化学工业出版社， ２００１：１０５－１１５． ［３］何华，叶海英．洛美沙星．Ｔｂ“配合物与ＢＳＡ相互作用 的荧光光谱研究［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００６，２６ 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（责任编辑李方）
