分子植物育种，２０１０年，第８卷，第１期，第５３—５８页 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２０１０，Ｖｏ１．８，Ｎｏ．１，５３—５８ 研究报告 Ａ Ｌｅｔｔｅｒ 马尾松体细胞胚胎发生相关基因ＰｍＳＥＲＫ１的克隆与表达分析 高燕 席梦利 王桂凤 杨立伟１施季森１ １南京林业大学林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室，南京，２１００３７；２上海大学上海市能源作物重点实验室，上海，２００４４４ 通讯作者，ｊｓｈｉ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．Ｃｒｌ 摘 要体细胞胚胎发生不仅是植物微繁、种质保存的有效手段，同时也是研究高等植物胚胎发育和遗传转 化的模式系统之一。本研究从马尾松未成熟合子胚诱导的胚性细胞团中成功克隆了体胚发生受体激酶基因 ＰｍＳＥＲＫ１。该基因全长２ ３０３ ｂｐ，包含完整的开放阅读框，编码６２６个氨基酸，其蛋白分子量约为６９ ｋＤ。序列分 析发现ＰｍＳＥＲＫ１与其它植物的ＳＥＲＫ基因高度同源。系统进化树重建表明，ＰｍＳＥＲＫ１与已知参与体胚发生 的关键ＳＥＲＫ基因聚为一类，如ＭｔＳＥＲＫ１、ＣｕＳＥＲＫ１、ＡｔＳＥＲＫ１和ＤｃＳＥＲＫ。表达分析显示：ＰｍＳＥＲＫ１在主 要的组织器官（根、茎、针叶等）略有表达；但在诱导培养的非胚性愈伤中没有检测到表达，而在经继代培养的 胚性愈伤中表达很高且逐渐增加，且在培养２０ｄ时达到最高。另外，在再生的子叶胚中，ＰｍＳＥＲＫ１的表达量 也很高。综上所述表明，ＰｍＳＥＲＫ１是与体胚发生相关的关键ＳＥＲＫ基因的直系同源基因，可以作为愈伤组织 胚性的标记基因。 关键词 马尾松，ＳＥＲＫ，体胚发生，表达模式 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰｍＳＥＲＫ１ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｓｓｏｎ Ｐｉｎｅ ＧａｏＹａｎ ＸｉＭｅｎｌｉ ＷａｎｇＧｕｉｆｅｎｇ ＹａｎｇＬｉｗｅｉ Ｓｈｉ Ｊｉｓｅｎ １ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆＦｏｒｅｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｉｉｎｇ，２１００３７；２ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏ— ｒｙ ｏｆＢｉｏ—Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｒｏｐｓ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＬｉ￣Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，２００４４４ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，ｊｓｈｉ＠ｎＶｕ．ｅｄｕ．ｃｎ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｍｐｂ．００８．００００５３ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｓ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｗａｙ ｔｏ ｍｉｃｒｏ・・ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｃｏｎｓｅｒ－－ ｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ，ａｎｄ ａｌｓｏ ａｓ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ． Ｗｅ ｈａｖｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ（ＳＥＲＫ）ｇｅｎｅ ｎｅｍｅｄ ＰｍＳＥＲＫ１ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｚｙｇｏｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ Ｍａｓｓｏｎ ｐｉｎｅ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ Ｌａｍｂ．）． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆＰｍＳＥＲＫＩ ｉｓ ２ ３０３ ｂｐ，ｃｏｎｔａｉｎ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ６２６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ６９ ｋＤ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰｍＳＥＲＫ１ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｈｉｈｇ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ＳＥＲＫ ｇｅｎｅ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ＰｍＳＥＲＫ１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｋｅｙ ＳＥＲＫ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｅｖｏｋｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍ— ｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＭｔＳＥＲＫ，，ＣｕＳＥＲＫ１，Ａ ｔＳＥＲＫ１，ａｎｄ ＤｃＳＥＲＫ，ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｔｏ ｏｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ＳＥＲＫ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｅｅｎ ａ １ｉｔｔｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｒｏｏｔ，ｓｔｅｍ，ｌｅａｖｅ ｅｔｃ．； ｔｈｅ ＰｍＳＥＲＫ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｂａｒｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｎｏｎ—ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｉ，Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅ— ｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｕｌｕｔｒｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｅａｌｌｉ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｇｒａｄｕａｌｌｙ，ｗｉｔｈ ａ ｐｅａｋ ａｔ ｔｈｅ ２０ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ，ｔｈｅ ｈｉ曲ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰｍＳＥＲＫ１ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ＰｍＳＥＲＫ１ ｃｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆｃａｌｌｉ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｍａｓｓｏｎ ｐｉｎｅ（Ｐ／ｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ Ｌａｍｂ．），ＳＥＲＫ，Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ Ⅵ ｖ、ｖ．ｍｏｌｐｌａｎｔｂｒｅｅｄ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１ ０．３９６９／ｍｐｂ．００８．００００５３ 基金项目：本研究由国家９４８项目（２００６—４一Ｃ０２）资助 马尾松体细胞胚胎发生相关基因ＰｍＳＥＲＫ１的克隆与表达分析 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆＰｍｓｅｒｋｌ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｓｓｏｎ Ｐｉｎｅ ５５ 的结构域，具有ＳＥＲＫ基因的典型序列特征。在近Ｎ 基因肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）为对照，用ＰｍＳＥＲＫ１的特异性 端有一个膜扩展结构域，以及近Ｃ端有１１个保守的 引物进行半定量ＲＴ—ＰＣＲ分析。电泳结果显示该基因 蛋白激酶域（图３）。有研究表明，不同植物ＳＥＲＫ基 在主要的组织器官（根、茎、针叶等）均略有表达；在增 因编码的蛋白质分子量、氨基酸组成都很接近。 殖的非胚性愈伤中没有表达，在继代培养的胚性愈伤 ＰｍＳＥＲＫ１编码的蛋白（６２６个氨基酸）分子量约为 中表达逐渐增加且在培养２０ ｄ时达到最高。此外，在 ６９ ｋＤ，预测的ｐＩ为６．１１。与已克隆的ＡｔＳＥＲＫ１基 再生的子叶胚中，ＰｍＳＥＲＫ１的表达量也很高（图５１。 因编码６２５个氨基酸、分子量６９ ｋＤ，Ａ Ｓ职 和 ＯｓＳＥＲＫ１编码的蛋白分别由６２７和６２８个氨基酸 ２讨论 组成，分子量分别是６９．１２５ ｋＤ和６９．５ ｋＤ。这些相 似性使得不同植物的ＳＥＲＫ蛋白具有保守的结构 特征，表明它们在植物生长发育过程中发挥了类似 的生物学功能（林庆光等，２００７）。 １．３ ＳＥＲＫ基因家族的系统进化分析 系统进化重建表明ＳＥＲＫ基因可以分为３个主 要的分支（图４１。第一分支主要包括一些主要的双子 叶植物；第二分支全部由单子叶植物组成。有趣的 是，同为双子叶植物的拟南芥单独归为一类。 单子叶分支可以明显分为３个亚类。已有研究 表明玉米的３个ＳＥＲＫ基因是有功能的。其中，Ｚｍ一 ．ｓ朋Ｋ２和Ｚ ５ＥＲ 明显来源于一次较近的基因复 制；而ＺｍＳＥＲＫ１则来自于更早的复制，发生在玉米 分化之前（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａ１．．２００１）。这也与玉米ＳＥＲＫ基 因在水稻中的ｏｒｔｈｏｌｏｇ（ＯｓＳＥＲＫ１）的进化位置相一 致，产生于玉米和水稻分化之后。同样水稻中也有一 些拷贝来源于较近的和较古老的基因复制事件。这 种模式表明一些拷贝遗传自古老的单子叶植物，而 另一些则源于较近的基因复制。另外，单子叶的木本 植物椰子树的ＳＥＲＫ单独具为一个亚类，表明其可 能来源于草本和木本植物分化之前。 双子叶植物分支则含有许多有证明有功能的 ＳＥＲＫ基因，如ＤｃＳＥＲＫ、ＭｔＳＥＲＫ１等。与单子叶分 支类似，５职Ｋ基因的拷贝来源于古老及较近的基因 复制事件。本研究克隆的ＰｍＳＥＲＫ１虽然是裸子植 物，但是在本研究的进化树中ＰｍＳＥＲＫ１明显与双子 叶植物聚为一类。这表明ＳＥＲＫ基因进化的复杂性及 深远的历史。但是，拟南芥中的５个拷贝则单独分为一 类，与已有的研究有不同： ｆ．ｓ职Ｋ 和ＡｔＳＥＲＫ２归为 一类，而其余的３个成员聚为一类（Ｓａｎｔｏｓ ｅｔ ａ１．，２００５）。 这也可能由于进化分析的算法不同，以及前人研究中 含有许多非全长的ＳＥＲＫ基因序列，导致结果的偏差。 １．４ 艇Ｒ 的表达分析 以马尾松旺盛生长期的根、一年生茎、针叶，胚 性愈伤继代培养不同时间及子叶胚为材料，同时管家 体细胞胚胎发生不仅是植物微繁、种质保存的 有效手段；同时也是研究高等植物胚胎发生和遗传 转化的的模式系统之一。在体细胞胚胎诱导培养过 程中，体细胞不仅组织形态及生理生化指标改变，而 且与该过程相关基因表达方式模式也发生变化。过 去二十多年，研究者们不断在寻找植物体细胞胚发 生过程中差异表达的基因。随着ＳＥＲＫ基因首先从 胡萝卜胚性细胞中发现，相继在其它许多物种中克 隆并鉴定该基因。它是一类体细胞胚发生相关类受 体蛋白激酶基因。 蛋白激酶是生物生命活动中极其重要的一类蛋 白，一直是研究的热点。具有蛋白激酶结构域及活性 的ＳＥＲＫ表达的非特异性和分布的广泛性，说明 ＳＥＲＫ基因功能也是非特异的。～方面，ＳＥＲＫ可以 作为体胚发生过程中胚性细胞的一种标记，标记胚 性细胞的形成及胚胎发生细胞；另一方面，它又在除 胚胎发生的其他发育过程中表达，表明ＳＥＲＫ基因 不仅在体胚发生的诱导或维持中起重要作用，还可 能广泛地参与植物生长发育的其它生物学过程。 为了分析参与马尾松体胚发生的ＳＥＲＫ基因的 结构与功能，本研究首次从裸子植物未成熟合子胚 诱导的胚性愈伤中成功克隆了一个全长基因，命名 为ＰｍＳＥＲＫ１。序列分析及进化分析表明其与已发现 的体胚关键ＳＥＲＫ基因具有很高的同源性，且为它 们的直系同源基因。如ＤｃＳＥＲＫ，它是从胡萝卜 （Ｏ￣ｕｓ ｃａｒｏｔａ）下胚轴悬浮培养的胚性细胞中分离出 第一个ＳＥＲＫ基因。表达分析发现它只在胚性细胞， 以及体胚发生过程中球形胚之前表达；而在非胚性 细胞及球形期后的体细胞胚中均不表达。表明Ｄｃ— ＳＥＲＫ是胡萝卜体细胞胚发生过程中过渡性表达的 特异基因，且可以作为细胞是否具有胚性的标记基 因（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａ１．，１９９７）。Ｓａｎｔｏｓ等（２００５）从可可树 （Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃｏ￣ｏｏ）叶芽诱导的胚性愈伤中克隆了 一 ＳＥＲＫ，除了在起始诱导和反复继代培养的胚性愈伤 中高度表达外，还在成熟体胚和合子胚中表达，表明 ＴｃＳＥＲＫ可能还参与胚胎的发育过程。而 阳 只 ５８ Ｍ分子植物育种 Ｏ１ｅｃｕｌａｒ ＰｌａＩｌｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ 、】ｌｎｖ、Ⅳ．ｍｏｌｐｌａｎｔｂｒｅｅｄ．ｏｒｇ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｍｐｂ．００８．００００５３ ｎ，同时以管家基因肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）为对照。 反转录酶（ＴａＫａＲａ）合成ｃＤＮＡ第一链。根据Ｇｅｎ． 伸５ ｍｉＢａｎｋ上胡萝ｂ、玉米、拟南芥、大麦、小麦、水稻和杨 树等植物ＳＥＲＫ基因序列的保守区域，设计了两条 兼并引物。ＰＣＲ反应程序为：９５℃预变性３ ｒａｉｎ；然后 ９５℃，３０ ｓ，５０℃，３０ｓ，７２℃，ｌ ｍｉｎ，３５个循环；７２℃， １０ ｍｉｎ，ＰＣＲ产物用ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＸＶ— 参考文献 Ｂａｕｄｉｎｏ Ｓ．，Ｈａｎｓｅｎ Ｓ．，Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｒ．，Ｈｅｃｈｔ Ｖ．Ｆ．Ｇ．，Ｄｒｅｓｓｅｌ－ ｈａｎｓ Ｔ．，Ｌｏｒｚ Ｈ．，Ｄｕｍａｓ Ｃ．，ａｎｄ Ｒｏｇｏｗｓｋｙ Ｐ．Ｍ．，２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｎｏｖｅｌ ｍａｉｚｅ ＬＲＲ ｒｅｃｅｐ— ｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＳＥＲＫ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ， ＧＥＮ公司）切胶回收。回收的产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔｅａｓｙ （Ｐｒｏｍｅｇａ）载体，转化蓝白斑筛选后，挑取白斑ＰＣＲ Ｐｌａｎｔａ，２１３（１）：１－１０ Ｂｅｃｒａｆｉ Ｐ．Ｗ．，１９９８，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， 验证后进行测序。 ３．５砌 衄ｌＪ全长ｃＤＮＡ的克隆 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，３（１Ｏ）：３８４－３８８ Ｃｈａｎｇ Ｓ．，Ｐａｒｙｅａｒ Ｊ．，ａｎｄ Ｃａｉｍｅｙ Ｊ．，１９９３，Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｐｉｎｅ ｔｒｅｅｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏ１． 取马尾松胚性愈伤组织ＥＳＭ的总ＲＮＡ ２ Ｉｘｇ， 根据ＲＡＣＥ试剂盒说明将其反转录合成ｃＤＮＡ，以 该ｃＤＮＡ为模板用５’和３’基因特异性引物及试剂盒 自带的ＲＡＣＥ引物分别扩增相应全长基因的５’和３’ 末端。扩增程序为：９４℃２ｍｉｎ；９４℃３０ ｓ，７２℃９０ ｓ，５ Ｒｅｐ．，ｌ１（２）：ｌｌ４－ｌｌ７ Ｈｅｃｈｔ Ｖ．，Ｖｉｅｌｌｅ—Ｃａｌｚａｄａ Ｊ．Ｐ．，Ｈａｒｔｏｇ Ｍ．Ｖ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ．Ｄ．Ｌ．， Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ Ｋ．，Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ Ｕ．，ａｎｄ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｓ．Ｃ．，２００１，Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｅｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ １ ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｏｖｕｌｅｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｅｎ— 个循环；９４℃３０ ｓ，７０℃１ ｍｉｎ，５个循环；９４℃３０ ｓ， ６０～６８￣Ｃ ３０ ｓ，７２℃１ ｍｉｎ，２５个循环；７２℃１０ ｍｉｎ； ４℃保存。退火温度根据所设计引物进行优化，扩增 产物经切胶回收后，取５Ｏ ｎｇ与ｐＧＥＭ．Ｔ载体 （Ｐｒｏｍｅｇａ）连接，插入片段与载体的摩尔比为３：１。取 ５ Ｌ连接产物转化ＤＨ５ａ感受态受体菌，涂板后 ３７℃培养过夜。基于蓝一白筛选法，从ＬＢ平板挑取 白色阳性克隆菌落接种到含３ ｍＬ ＬＢ液体培养液的 １０ｍＬ管中，３７￣Ｃ培养过夜取，１ ｍＬ菌液质粒提取试 剂盒Ｒａｐｉｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ操作说明书提 取外源质粒ＤＮＡ，余下菌液加入甘油至终浓度１５％， ｈａｎｃｅｓ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ１．， １２７（３）：８０３—８１６ Ｌｉｎ Ｑ．Ｇ．，Ｃｕｉ Ｂ．Ｍ．，ａｎｄ Ｐｅｎｇ Ｍ．，２００７，Ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＳＥＲＫ ｇｅｎｅｓ ｆａｍｉｌｙ，Ｙｉｃｈｕａｎ（Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ），２９（６）：６８１－６８７（林 庆光，崔百明，彭明，２００７，ＳＥＲＫ 基因家族的研究进展， 遗传，２９（６）：６８１．６８７） Ｓａｎｔｏｓ Ｍ．Ｄ．Ｏ．，Ｒｏｍａｎｏ Ｅ．，Ｙｏｔｏｋｏ Ｋ．Ｓ．Ｃ．，Ｔｉｎｏｃｏ Ｍ．Ｌ．Ｐ．，Ｄｉａｓ Ｂ． Ｂ．Ａ．，ａｎｄ Ａｒａｇａｏ Ｆ．Ｊ．Ｌ．，２００５，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅ ｃａｃａｏ ｔｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ（ＳＥＲＫ）ｇｅｎｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１６８（３）： ７２３．７２９ ７０℃保存。按ＡＢ公司的ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ．Ｄ．，Ｇｕｚｚｏ Ｆ．，Ｔｏｏｎｅｎ Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｓ．Ｃ．，１９９７， Ａ ｌｅｕｃｉｎｅ・－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－・ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ ｍａｒｋｓ ｓｏｍａｔｉｃ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｔｏ ｆｏｒｍ ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐ— Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ进行５’端双向测序反应，在 ＡＢ３ １３０ｘｌ遗传分析仪上电泳。 ３．６ ＰｍＳＥ兄 序列的分析 ｍｅｎｔ，１２４（１０）：２０４９—２０６２ Ｓｈａｒｐ Ｗ．Ｒ．，Ｓｏｎｄａｈｌ Ｍ．Ｒ．，Ｃａｌｄａｓ Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ Ｍａｒａｆｆａ Ｓ…Ｂ １９８０， Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｅｘｕａｌ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔ． Ｒｅｖ．．２：４７—５４ 运用ＤＮＡＭＡＮ５．２软件去除载体序列进行拼接， 分析这些基因可能编码的蛋白质序列，并在ＧｅｎＢａｎｋ 中用ＢＬＡＳＴｘ进行同源性分析，并用该软件进行多 重比对（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）分析。进一步用ＭＥＧＡ４．０ Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｆ．，２００８，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｎｄ ａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｄｉｆｅｒ－ ｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｘｙｌｅｍ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ 软件构建ＳＥＲＫ基因家族的系统进化树。 ３．７ Ｐｍ 的表达模式分析 ｉｆｒ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｂｙ－ ｂｒｉｄｉａｔｚｉｏｎ，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｈ．Ｄ．，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒ－ ｓｉｔｙ，Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒｓ：Ｓｈｉ Ｊ．Ｓ．，ＰＰ．３６（王桂凤，２００８，杉木木材 形成过程中差异表达基因的鉴定与功能分析，博士学位 论文，南京林业大学，导师：施季森，ｐｐ．３６） Ｚｈａｎｇ Ｘ．Ｒ．，１ ９９８，Ｌｅｕｃｉｎｅ—ｉｃｈ ｒｅｐｅａｔｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ 分别提取马尾松旺盛生长期的根、一年生茎、 针叶，胚性愈伤继代培养不同时间及子叶胚期的 总ＲＮＡ，反转录合成第一链ｃＤＮＡ，ＰＣＲ反应条件 为９４℃预变性１ ｍｉｎ，随之９４℃３０ ｓ，５８℃３０ ｓ， ７２℃３０ ｓ，分别２３、２８和３３个循环，最后７２℃延 ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．Ｒｅｐ．，ｌ６（４）：３０１－３１ １ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｊ．Ｌ．，１９９３，Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ：ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＨｉｇｈｅｒＰｌｎｔａｓ，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５（１ ０）：１４１１－１４２３
