福建农业学报２８（４）：３０１～３０８，２０１３ Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１００８—０３８４（２０１３）０４—３０１—０８ 王劭，程晓霞，陈少莺，等．番鸭小鹅瘟弱毒Ｄ株ＮＳ蛋白抗原位点特征分析［Ｊ］．福建农业学报，２０１３，２８（４）：３０１—３０８． ＷＡＮＧ Ｓ，ＣＨＥＮＧ Ｘ—Ｘ，ＣＨＥＮ Ｓ—Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄ－ｓｔｒａｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｍｕｓｃｏｖｙ Ｄｕｃｋ—ｏｒｉｇｉｎ Ｇｏｏｓｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＮＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ口］．Ｆｕｊ ｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１３，２８（４）：３０１—３０８． 番鸭小鹅瘟弱毒Ｄ株ＮＳ蛋白抗原位点特征分析 王 劭 ，程晓霞 ，陈少莺ｈ。，朱小丽 ，陈仕龙 。，林锋强 ，李兆龙 （１．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建２．福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州 ３５００１３； 福州 ３５００１３） 摘要：为获得番鸭小鹅瘟病毒弱毒株（ＭＤＧＰＶ—Ｄ）非结构蛋白ＮＳ基因的相关信息，根据已发表的ＭＤＧＰＶ— ＰＴ株全基因序列，应用ＤＮＡＳｔａｒ分子生物学软件设计１对引物，采用高保真ＰＣＲ技术扩增ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ 全基因序列。对番鸭小鹅瘟病毒疫苗弱毒Ｄ株（ＭＤＧＰＶ－Ｄ）ＮＳ基因进行克隆、测序，并利用生物信息学技术 分析ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ蛋白的同源性、遗传衍化、Ｎ一糖基化位点、磷酸化位点、Ｂ细胞抗原表位、Ｔ细胞抗原表 位及其二级结构。结果表明，Ｄ株ＮＳ全基因大小为１ ８８４ ｂｐ，编码６２７个氨基酸（ＧｅｎＢａｎｋ登录号： ＪＦ９２６６９６），与ＭＤＰＶ ＮＳ基因的亲缘性最近核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为９７．９ ～９８．６ ，９７．６ ～ ９８．２％；ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白具有３个潜在的Ｎ一糖基化位点和２７个磷酸化位点，可能存在１１个Ｂ细胞抗原表 位，１３个ＣＤ８ ＣＴＬ表位，１Ｏ个ＣＤ４ Ｔｈ抗原表位；二级结构分析显示，ａ螺旋和无规则卷曲含量高，分别为 ４Ｏ．６７ 、４１．１５ ，而Ｂ转角仅占４．６３ 。与亲本强毒ＰＴ株相比，弱毒Ｄ株的ＮＳ蛋白存在２个定点突变，分 别位于核苷三磷酸区域（第３３８位氨基酸）与ＣＤ４ Ｔｈ抗原表位（第２２５位氨基酸）。 关键词：番鸭小鹅瘟病毒；ＮＳ蛋白；抗原表位；分子特征 中图分类号：Ｓ ８５８ 文献标识码：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄ・。ｓｔｒａｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｍｕｓｃｏｖｙ Ｄｕｃｋ＿。ｏｒｉｇｉｎ Ｇｏｏｓｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＮＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ＷＡＮＧ Ｓｈａｏ ，ＣＨＥＮＧ Ｘｉａｏ—ｘｉａ ，ＣＨＥＮ Ｓｈａｏ—ｙｉｎｇ ，ＺＨＵ Ｘｉａｏ—ｌｉ ，ＣＨＥＮ Ｓｈｉ—ｌｏｎｇ ， ＬＩＮ Ｆｅｎｇ－ｑｉａｎ ．ＬＩ Ｚｈａｏ—ｌｏｎｇ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＦｕＪｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｕｊｉａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｚｈｏｕ，ＦｕｊＪａｎ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔ０ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＳ ｇｅｎｅ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ（Ｃａｉｒｉｎａ ｍｏｓｃｈａｔａ）ｏｒｉｇｉｎ Ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＧＰＶ）Ｄ ｓｔｒａｉｎ，ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｙ ＤＮＡＳｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＭＤＧＰＶ－ＰＴ ｓｔｒａｉｎ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｗｅ ｅｘａｍｅｄ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ，ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎ—ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ， ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ， Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ＮＳ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ１ ８一Ｔ ｖｅｃｔｏｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＮＳ ｇｅｎｅ ｏｆ ＭＤＧＰＶ—Ｄ ｓｔｒａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １ ８８４ ｂｐｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ６２７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （ＧｅｎＢａｎｋ ｎｕｍｂｅｒ：ＪＦ９２６６９６）．Ｔｈｅ ＭＤＧＰＶ—Ｄｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ＭＤＰＶ（ｎｔ：９７．９ 一 ９８．６ ，ａａ：９７．６ 一９８．２ ）．Ｉｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ３ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎ—ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ２７ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ１ａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ＭＤＧＰ、ＬＤ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ １１ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，１３ ＣＤ８＋ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｎｄ １０ 收稿日期：２０１３—０３—１１初稿；２０１３—０４—１０修改稿 作者简介：王劭（１９７９一），男，硕士，助理研究员，主要从事分子病毒学研究（Ｅ—ｍａｉｌ：ａｇｒ—ｓｈａｗｎ＠１２６．ｃｏｒｎ） 程晓霞（１９７２一），女，副研究员，主要从事兽医免疫学研究（Ｅ—ｍａｉｌ：ｅｘｘｌｊｙ＠１２６．ｃｏｒｎ）。程晓霞和王劭对本文有同等贡献。 通讯作者：陈少莺（１９６２一），女，研究员，主要从事畜禽传染病学研究（Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｓｙ５８＠１６３．ｃｏｒｎ） 基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１００３０１２）；福建省自然科学基金项目（２０１２Ｊ０１１１０）；福建省财政专项——福建省农 业科学院科技创新团队建设项目（ＳＴＩＦ—Ｙ０２） ３Ｏ２ 福建农业学报 第２８卷 ＣＤ４ Ｔｈ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｓ ｗｅｌ１．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ， ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ａｎｄ ｂｅｔａ ａｎｇｌｅ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ４０．６７ ，４１．１５ ａｎｄ ４．６３ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ＰＴ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎ Ｄ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔＷＯ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ｏｎｅ ｗａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＴＰ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ａｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ３３８，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｉｎ ａ ＣＤ４ Ｔｈ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ２２５．Ｔｈｅｓｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＭＤＧＰＶ，ａｎｄ ｂｅｎｅｆｉｔｔｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＭＤＧＰＶ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＭＤＧＰＶ；ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｅｐｉｔｏｐｅ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ 小鹅瘟病是由鹅细小病毒（Ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ， Ｏｍｅｇａ公司（美国）。 ＧＰＶ）引起雏鹅和雏番鸭的疫病，该病最早于 １９５６年在我国江苏等养鹅地区发生，并很快蔓延 到全国各养鹅地区，但极少见番鸭发病，方定一 等ｌ１］证实本病病原是鹅细小病毒。番鸭小鹅瘟病是 １９９７年以来在福建省莆田、福清等地番鸭饲养区 暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生。临床 上该疫病以雏番鸭发生腹泻、肠黏膜脱落形成栓塞 为主要特征，发病率５０ ～７０ 、病死率４０ ～ ６５ ，给番鸭养殖业造成较大经济损失。本课题组 经病原分离鉴定为小鹅瘟病毒，并选育出安全性好 免疫原性强的弱毒株（ＭＤＧＰＶ—Ｄ），可用于研制 活疫苗预防该病ｌ＿２］。 ＧＰＶ为细小病毒科细小病毒属成员，为单股、 线性ＤＮＡ病毒，与番鸭细小病毒（Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＭＤＰＶ）理化特征相似，基因组大小 约为５ ０００ ｂｐ，主要由５ 端的非结构蛋白ＮＳ基因 与３ 端的病毒衣壳蛋白 基因构成［３］。ＮＳ蛋白 抑制宿主细胞ＤＮＡ复制，与病毒毒力有关，并在 病毒的复制、包装等各个阶段均起到关键的作 用ｒ４］。本研究通过测定ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ基因核 苷酸序列并推导其ＮＳ蛋白氨基酸序列，运用分子 生物学软件对其进行生物信息学分析，为进一步研 究ＭＤＧＰＶ的基因遗传变异与毒力变化之间相关 性奠定基础。 １材料和方法 １．１ 病毒株 ＭＤＧＰＶ弱毒株（ＭＤＧＰＶ—Ｄ）由亲本强毒株 （ＭＤＧＰＶ—ＰＴ）传代致弱，由本所动物病毒室鉴定 并保存。 １．２试剂和载体 动物血液、组织与细胞ＤＮＡ提取试剂盒购自 Ｑｉａｇｅｎ公司（美国）；Ｅａｓｙ—Ａ ｈｉｇｈ—ｆｅｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ购自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司（美国）； ｄＮＴＰｓ和ｐＭＤ１８一Ｔ载体购自大连宝生物工程公 司；胶回收试剂盒、质粒小提纯化试剂盒购白 １．３引物设计 从ＧｅｎＢａｎｋ中读取ＭＤＧＰＶ—ＰＴ株ＮＳ基因 序列，用Ｏｌｉｇｏ ６软件设计合成了１对特异性引物， 扩增ＮＳ基因完整ＯＲＦ（１ ８４４ ｂｐ）片段的上、下 游引物为：ＮＳＦ：５＇－ＧＧＴＣＧＧＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡ— ＣＴＴＴＣＴ一３ ；ＮＳＲ： ５＇－ＡＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴ— ＴＡＴＴＧＴＴＣＡＴ一３ 。由宝生物工程（大连）有限 公司合成。 １．４病毒ＮＳ基因ＰＣＲ扩增 １．４．１ 病毒ＤＮＡ提取 取２００ Ｌ病毒液，按 Ｑｉａｇｅｎ公司血液、组织与细胞ＤＮＡ提取试剂盒说 明书操作提取病毒ＤＮＡ。 １．４．２ ＰＣＲ扩增ＮＳ基因 采用５Ｏ Ｌ体系，以 制备好的病毒ＤＮＡ ５ Ｌ作模板，加入相应的上、下 游引物（２Ｏ ｐｍｏｌ・Ｌ ）各１ Ｌ，２．５ ｍｍｏｌ・Ｌ ｄＮＴＰｓ １ Ｌ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ Ｌ，２Ｏ ｍｍｏｌ・Ｌ一 ＭｇＣ１２ ０．８肚Ｌ，Ｅａｓｙ—Ａ高保真ＤＮＡ聚合酶０．２ Ｌ，灭菌水３６ Ｌ。扩增程序为：９５℃预变性５ ｍｉｎ，９４℃变性１ ｒａｉｎ，５２℃退火１ ｍｉｎ，７２ ｏＣ延伸 ２ ｒａｉｎ，３５个循环，７２℃总延伸１０ ｍｉｎ。结束后取 ＰＣＲ产物５ Ｌ，１ 琼脂糖凝胶电泳观察ＰＣＲ扩 增结果。 １．５病毒ＮＳ基因序列测定 ＭＤＧＰＶ ＮＳ基因ＰＣＲ扩增产物用１ 的琼脂 糖凝胶电泳，将电泳目的条带按Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ）说明书进行回收，按ｐＭＤ１８一Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ说明书进行连接，连接产物转化大肠杆菌 感受态细胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ，然后涂布 含氨苄青霉素抗性的ＬＢ琼脂平板，３７℃倒置过夜 培养，挑取单菌落进行扩大培养，按Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ工（Ｏｍｅｇａ）说明书提取质粒，ＰＣＲ鉴定为阳 性者送宝生物工程（大连）有限公司测序。用 Ｓｅｑｕｉｎ程序申请ＭＤＧＰＶ—Ｄ ＮＳ基因核苷酸序列登 录号。 ｌ＿６ ＮＳ基因核苷酸及其推导氨基酸序列分析 应用ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ７．１软件中的 Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序中的Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ方法将ＭＤＧＰＶ—Ｄ 第４期 王劭等：番鸭小鹅瘟弱毒Ｄ株ＮＳ蛋白抗原位点特征分析 ３０３ 株ＮＳ基因核苷酸及推导氨基酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ 数据库上发布的１１个ＭＤＧＰＶ、ＧＰＶ与ＭＤＰＶ， 参考毒株ＮＳ基因序列进行同源性比对与分析。本 ２ 结果与分析 ２．１ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因克隆鉴定及序列测定 研究中所用的ｌ１个ＧＰＶ与ＭＤＰＶ参考毒株分别 为：ＧＰＶ ＤＹ株（登录号：ＥＦ５１５８３７）；ＧＰＶ ８２— ０３２１ｖ株（登录号：ＥＵ５８３３８９）；ＧＰＶ ８２—０３２１株 （登录号：ＥＵ５８３３９０）；ＧＰＶ ０６—０３２９株（登录 号：ＥＵ５８３３９１）；ＧＰＶ ＶＧ３２／１株（登录号： ＭＤＧＰＶ—Ｄ株的ＮＳ基因序列扩增及重组质粒 ＰＣＲ鉴定结果（图１），得到约为１．８ ｋｂ的ＤＮＡ 片段。条带经回收纯化后，连接到ｐＭＤ１８一Ｔ载 体，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，筛选阳性克隆。阳性重 组质粒送往宝生物工程（大连）有限公司进行双向 ＥＵ５８３３９２）；ＧＰＶ ＹＧ株（登录号：ＡＦ４１６７２６）； 测序，测序结果表明，克隆获得的ＭＤＧＰＶ—Ｄ株 ＧＰＶ Ｂ株（登录号：Ｕ２５７４９）；ＭＤＧＰＶ ＰＴ 株（登录号：ＪＦ９２６６９５）；ＭＤＰＶ ＦＭ株（登 录号：ＮＣ一００６１４７）；ＭＤＰＶ Ｐ株（登录号： ＪＦ９２６６９７）；ＭＤＰＶ Ｐ１株（登录号：ＪＦ９２６６９８）。 １．７ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因遗传进化树分析 应用Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序中Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒｅｅ算法 将ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因序列与上述ＭＤＧＰＶ、 ＧＰＶ与ＭＤＰＶ参考毒株相应的ＮＳ基因序列进行 比对，构建遗传进化树。 １．８ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白Ｎ一糖基化位点、磷酸 化位点预测 应用在线软件ＮｅｔＮＧｌｙｃ １．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃ ｅｓ／ＮｅｔＮ Ｇｌｙｃ／）进行Ｎ一糖基化 位点的预测。应用在线软件ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／）进行磷酸化 位点的预测。 １．９ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白亲水性、柔性区、表 面可能性与抗原指数分析，二级结构预测及其Ｂ 细胞抗原表位预测 应用ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ７．１软件中的 Ｐｒｏｔｅａｎ程序对ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ蛋白的亲水性、 柔性区、表面可能性与抗原指数进行分析，采用 ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）蛋白质 结构预测服务器预测ＭＤＧＰＶ Ｄ株ＮＳ蛋白质二级 结构，对预测结果进行分析，排除二级结构中位于 ａ一螺旋和Ｊ３一折叠内不易形成表位的序列，并使用 Ｂｃｅｐｒｅｄ Ｂ细胞表位预测服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｂｃｅｐｒｅｄ／）预测Ｂ细胞表 位，结合二级结构预测结果，选取可塑性好与抗原 性强的片段为候选表位，待进一步分析。 １．１０ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白Ｔ细胞抗原表位预测 采用ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／提供的软件 ｎＨＬＡＰｒｅｄ和ＰｒｏＰｒｅｄ分别进行ＭＨＣ一工和ＭＨＣ一 Ⅱ性的Ｔ细胞抗原表位预测，分析ＭＤＧＰＶ— ＰＴ株与Ｄ株之间ＭＣＨ工型ＣＤ８ 细胞毒Ｔ细胞 表位与ＭＣＨⅡ型ＣＤ４ Ｔ细胞表位突变情况。 ＮＳ基因为１ ８８４ ｂｐ，包含完整的开放阅读框 （ＯＲＦ） ２０００ｂｐ １ ０００ｂｐ ７５０ｂｐ ５００ｂｐ ２５０ｂｐ １００ｂｐ 图１ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因ＰＣＲ扩增产物及重组质粒 ＰＣＲ鉴定结果 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＭＤＧＰＶ—Ｄ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ 注：Ｍ为ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００；１为ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ；２为ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｉｍｄ ｏｆ ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｇｅｎｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ；３为Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ２．２ ＭＤＧＰＶ＿Ｄ株ＮＳ蛋白的Ｎ一糖基化位点、磷 酸化位点预测 经在线软件ＮｅｔＮＧｌｙｃ １．０预测得知ＭＤＧＰＶ－ Ｄ株ＮＳ蛋白含有３个Ｎ一糖基化位点：１５０一 ＮＫＴＶ、２２５一ＮＹＳＮ、３６０一ＮＷＴＮ。在线软件 ＮｅｔＰｈｏｓ ２．０预测到ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白存在如 下磷酸化位点：丝氨酸（Ｓｅｒ）有１７个位点（１１、 ２３、１１７、１２２、２００、２４０、２５１、２５４、３９１、４２２、 ４３４、４５３、４６４、５２９、５４２、５４６、５８７）；苏氨酸 （Ｔｈｒ）含有６个位点（１４４、３３９、３４０、３８５、 ５１８、５５２）；酪氨酸（Ｔｙｒ）有４个位点（９５、 ２５２、２８５和３１３）（图２）。 ２．３ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白结构与细胞抗原表位 预测 ２．３．１ ＮＳ蛋白二级结构与Ｂ细胞抗原表位预测 ＳＯＰＭＡ服务器分析结果显示，ＭＤＧＰＶ—Ｄ株 ３０４ 福建农业学报 第２８卷 ＮＳ蛋白的二级结构如下：ａ一螺旋区域（ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ）：２５５个氨基酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ａａ）占 ４０．６７ ９／６；ｌ３一折叠区域（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）：８５个ａｍ 一 ｃ－ ａｄ ｃａ ＿一 Ｌ。ｌＩ４＿ａ 占１３．５６ ９，６；Ｂ一转角区域（ｂｅｔａ ｔｕｒｎ）：２９个ａａ占 表面可能性与抗原指数分析，并使用Ｂｃｅｐｒｅｄ Ｂ细 胞表位预测服务器分析，结果显示：ａａ ａａ１ ３９ ｌ０５、、 、 ａａ１６１ １ ６７、ａａ３３６—３４２、ａａ３７９—３８３、ａａ４０１ ４０８ａａ 一 。 、ａａ 。一 。 、ａａ 。。、ａａ 。 一 。、ａａ 。 一 区 ４．６３ ；无规则卷曲区域（ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ）：２５８个 ａａ占４１．１５ （图３、４）。综合亲水性、柔性区、 Ｈ－ｔＰｈ０－￡．日● 段有可能成为ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ蛋白优势Ｂ细胞 表位（图５）。 ｉｔ●＿ ｉｎ Ｓ●ｑ…ｃ● ｐｒ－ｄｉｃｔ●ｄ ｐｈ口－ｐｈａｒｕｌ－ｔＩｔ…ｌ Ｉ Ｉ． ．Ｊ… Ｉ ｉ Ｉｌ ｉ ｌ Ｉ ｊ｝ Ｉ ．． ｉ１Ｉ１ ．ａ日口 日０ｑ…口－■口ｊｉｔｉ口ｎ ■ａ自 图２ ＭＤＧＰＶ Ｄ株ＮＳ蛋白磷酸化位点预测 Ｆｉｇ．２ Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｈ０ｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ Ａ１ｐｈｅｒ ｈｅ１ｉｘ ３１ｄ Ｂｅｔ矗日Ｅｔ邑ｈｍ１ｉｘ ｂｒｉｄｇ芒 ｃｕｒｎ Ｐｉ ｈＥ１ｉｘ ＣＨｈ） ＣＧ口】 ＣＩｉ＇ ＣＢｂ＇ ｃＴｃ】 ｃｓ Ｉ ｃｃ Ｉ ＥｘｔｅｎｄＥｄ ａｔｒａｎｄ ＣＥｅ＇ Ｂｅｎｄ ｒＥ口ｉ０ｎ Ｒａｎｄ口ｚｎ ｃ口ｉ１ ＾岫ｉ口口 ｔＩｔＥ日 ｃ’Ｉ ｃ丑ｔＥａ ＯｔｈＥｒ 图３ ＭＤＧＰＶ－－Ｄ株ＮＳ蛋白二级结构分布分析 Ｆｉｇ．３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ １Ｄ ２口 ３０ ｑＤ ５口 ６口 ７口 ＨＡＬＳＲＰＬＱＩＳＳＤＫＦＹＥＶＩＩＲＬＰＳＤＩＤＱＤＶｐＧＬＳＬＮＦＶＥⅥＬＳＴＧＶⅡＥＰＴＧ工 Ｎ】ＩＥＨＶＮＬＰＨＶＴＬＡＤＫＩＫＮＩ ｈｈ ０ｃ ０ｃｃ 七ｈｈｈｈ芒芒芒芒芒ｃ ｃ ｃｃ０ ｃ ｃ ｈｈｈｈｈｈｈ００ ｃｃｃｅｃｃ ｈｈｈｈｃ Ｆ １０ＲＷＮＱＦＮＱＤＥＴＤＦＦＦＱＬＥＥＧＳＥＹＩＨＬＨＣＣ ＩＡＱＧＮＶＲＳＦＶＬＧ－ＲＹｅＳＱＩＲＤ５ ＩＬＲＤＶＹＥＧＫａＶＫＩＰＤＨＦＳ ｈｈｈｈｈｈｈｃｃＣＣＣＣｃ已ｅｅｅｈｃｔｔｃｃ 已ｅｅｅ已￣ｅｅｃｔｔＣＣＣ 已 ｅＣＣＣ ＣＣ ＣＣｅｅ已 ＩＴＫＴＲＲＧＧ（￣ＮＫＴＶＴＡ＾ＹＩＬＨＹＬ ＩＰＫＫＱＰＥＬ０可＾ＦＴＮＭＰＬＦＴＡＡＡＬＣＬ０ＫＲＱＥＬＬＤＡＦＱＥＳＥＮＮＡＶＶＱＥＤ０ 芒巳ｃ０ ｔ七ｃｃｅ芒芒已 ｈｈｈｈｈｈｈｅｃｃｃ ｃ ｈｇｅｔ＝ｈ ｅ Ｃ ＣＣ ＣｅＣＣＣ ＡＳＴＶＡＰＬ ＩＳＮＲＡＡＥＮＹＳＮＬＶＤ耵Ｌ ＩＥＭＧＩＴＳＥＥＱＮＬＴＥＮＫＥＳＹＲＳＦＱＡＴＳＳＮＮＲ￣ｌ（ＡＡＬＥＮＡＲＡＥＭＬＬＴＫ ＣＣ ０ｅｅＣＣＣＣ Ｃ七 ＣＣＣｈｈｈｈｈｈｔ ｃｈｈ 已芒ｈＣＣＣ ｃ Ｔ＾ＴＤＹＬ工ＧＫＤＰＶＬＤ工ＴＫＮＲＩＹＱ工ＬＫＬＮＮＹＮｐＱＹＶＧＳ工ＬＣＧＶＶＫＲＥＦＮＫＲＮ＾工ＶＬＹＧＰＶＴＴＧＫＴＮ工ＡＥＡ工Ａ ｃｈｈｈｅ芒皂ＣＣＣＣＣｈｈ ｃｈｈｈｈｈｅＥｅｅｅｔｔｃ ｃｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈ七ｃｃＣＣＣｃ芒ｅ皂芒已ｃ ｃｅｃｃｃｈｈｈｈｈｈｈｈ Ｈ ＶＰＦＹＧＣＶＮＶＴＮＥＮＦＰＦＮＤＣＶＤＫＨＬ工ⅡＶＥＥＧＫＭＴＮＫＷＥＳ＾ＫＡＩＬＧＧ昌＾ＶＲＶＤＱＫＣＫＧＳＶＣ ＩＥｐＴＰＶ工工 ｈｈ ｃｃｅｅ芒ｅｅｃｃｃ ｃ ＣＣＣｃ ｃｈｅ皂ｅ已已 七Ｃ ｃ 七ｔ０ｅｅｅｅｅ七七 Ｃ ｅｅＣｅＣＣ０已ｅｅ ＴＳＮＴＤＨＣＭ工ＶＤＧＮ５ＴＴＨＥＨＲ工ＰＬＥＥＲ五ＦＱ工ＶＬ嚣ＨＫＬＥＧＮＬＧＫ工暑ＫＫＥＶＲＥＦＦＫＵＡＮＤＮＬＶＰＶＶ５ＥＦｌ（ＶＰＴ ｅｔｔｃｃｅｅｅ皂已ｔ七 已已ｅｅ ｃｃ ｈｈｈｈｈｈｈｅｅｅｅｅｃ ｃｔｔｃｃｃｃ ｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｈｔ七七ＣＣＣＣＣＣＣｃｃＣＣＣ ＮＥＱＴＫＬＴＥＰＶＰＥＲＡＮＥＰＳＥＰＰＫＩⅡＡＰＰＴＲＥＥＬＥＥ工ＬＲＡＳＰＥＬＦＡ５ＶＡＰＬＰＳＳＰＥＲＳＰＥＲＫＫＴＲＲＤＹ０ ＲＣ ０ｃｃｃｃｃｃ ｃｃｃｃｃｃ ｃ００ｃｃｃ ｃｅｈｈｈｈｈｈｈｈｃ ｃｃｈｈｈｅ０ ｃｃ ＣＣＣ００ ｃｈｈｈｈｈｃｃ ｃｈｈｈ ＡＭＨＳＬＤＮ５瑚 ⅣＦＥＣＬＥＣＥＲＡＮＦＰＥＦ０５ＬＧＥＮＦＣＮ０ＨＧＶＹＤＣＡＦＣＮＥＬＲＤＥＨＥＥ工ＥＨＶＦＡ工ＤＤＭＥＮＥＱ ｈｈｈｈｃｃ ｃｃｈｈｈｈｈ七ｃ ｃｃｃｃＣＣＣｃ 图４ ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ蛋白二级结构预测 Ｆｉｇ．４ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ ｓｔｒａｎｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ 注：图中字母Ｃ、Ｈ、Ｅ分别表示无规卷曲、ａ螺旋、口折叠结构。 第４期 王劭等：番鸭小鹅瘟弱毒Ｄ株ＮＳ蛋白抗原位点特征分析 ３０５ 帖卯０ ７５ １叩１２５ １”５Ｄ ｌ０ ７５ ２００ ２２５ ２５０ ２ ３００ ３２５ ３锄３７ｔ ４０口啦５ ４６０ ４７５ １５００ ５２＋５ ８８０ ６７５ ａＤＯ ０２５ ＩＨｙｄｍｐｈ￣ｉｔｙ Ｐｌｏｔ・ Ｅ－Ｄｏｏｌｉｔｔｉｅ ｌＦｌｅｘｉＨｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ－Ｋａｑ￣ｌｕｓ・Ｓｃｈｕｌｚ ｌ￣ｉｇｍｎｉｏ Ｉｎｄｅｚ・Ｊａｍｅｓｏｎ－Ｗｏｌｆ ［３Ｓ￣ｍ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｐｉｎｔ－Ｅｍｉｎｉ 图５ ＭＤＧＰＶ－Ｄ株ＮＳ蛋白亲水性、柔性区、抗原指数、表面可能性的分析 Ｆｉｇ．５ Ａｎａｌａｙｓｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ，ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ，ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｎｄｅｘ，ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＭＤＧＰＶ Ｄ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ２．３．２ ＮＳ蛋白Ｔ细胞抗原表位预测Ｔ细胞表 ２．４ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因同源性分析 位可以分为ＭＣＨ Ｉ型ＣＤ８ 细胞毒Ｔ细胞表位 应用ＳｅｑＭａｎ分析软件对ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基 （ＣＬＴ表位）与ＭＣＨ ＩＩ型ＣＤ４ Ｔ细胞表位（Ｔｈ 因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为：ＪＦ９２６６９６）的测序结果 表位）。分别使用ｎＨＬＡＰｒｅｄ和ＰｒｏＰｒｅｄ软件分析 进行分析。运用ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ７．１软件中 结果显示，ＣＴＬ表位根据不同ＨＬＡ类分子锚定残 的Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序对ＭＤＧＰＶ、ＧＰＶ与ＭＤＰＶ １２ 基（ａｎｃｈｏｒ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）的特征加以预测，共有１３ 条ＮＳ基因序列进行比对，没有出现碱基缺失和插 个肽段被预测为ＨＬＡ—Ａ２型特异性抗原表位，分 一叫 入的变异。Ｄ株与ＰＴ株核苷酸和氨基酸序列同源 别位于： ａａ∞ 、ａａ 。、 ａａ¨卜”。、ａａ” ８２、 性分别为９９．６ 、９８．９ ；与ＧＰＶ参考病毒株核 ａａ２０９—２１７ａａ２２５—２３３ａａ２７８—２９２ａａ３３１—３４１ａａ３４８—３５６、、、、、 苷酸和氨基酸序列同源性分别为７９．７ ～８１．８ ， ａａ。。。一 。 ａａ 一 。 ａａ 一 。 、、、ａａ 。 一 。。区段；Ｔｈ表 ９０．０ ９／６～９Ｏ．８ ；与ＭＤＰＶ参考病毒株核苷酸和 位肽段按得分由高到低，分别位于：ａａ 蝎 、 氨基酸序列同源性分别为９８．４％～９９．０ ， ａａ２５２—２６Ｏａａ９５一ｌＯ３ａａ２３２—２４Ｏａａ３Ｏｌ一３Ｏ９ａａ５６９—５７７、、、、、 ９７．９ ～９８．４ （表１）。 ａａ 。一 ａａ。。 一 。。ａａ 一 。、、、ａａ。 一。 区段。 表１ ＭＤＧＰＶ—Ｄ株与ｌｌ株ＧＰＶ，ＭＤＧＰＶ参考毒株ＮＳ基因的同源性比较 Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＮＳ ｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＭＤＧＰＶ Ｄ ａｎｄ ＧＰＶ．ＭＤＰＶ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ （单位／ ） 注：表中所列数据右上部为核苷酸序列的同源性，左下部为推导的氨基酸序列的同源性。 第４期 王 劭等：番鸭小鹅瘟弱毒Ｄ株ＮＳ蛋白抗原位点特征分析 ３０７ ３ 讨 论 ＭＤＧＰＶ—Ｄ株是目前国内率先研究成功的细胞 传代致弱疫苗毒。ＮＳ蛋白是ＧＰＶ主要的非结构 蛋白并对衣壳蛋白基因的启动子起正调节作用，对 ＭＤＧＰＶ Ｄ株ＮＳ蛋白基因进行扩增测序和生物信 息学分析，有助于研究ＭＤＧＰＶ致弱的分子机制， 丰富其分子生物学资料。 本试验应用Ｑｉａｇｅｎ血液与组织ＤＮＡ提取试 剂盒分离病毒ＤＮＡ，保证了样本单链ＤＮＡ模板 质量，采用Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ高保真ＰＣＲ克隆酶扩增目 标基因片段，防止了ＰＣＲ反应体系构建时引物和 模板发生降解，为ＭＤＧＰＶ的ＮＳ基因扩增提供了 高灵敏度和特异性ＰＣＲ反应条件。 ＭＤＧＰＶ—Ｄ株ＮＳ基因与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的 欧洲与亚洲２个地区、不同宿主和不同毒力的１ｌ 株ＭＤＧＰＶ、ＧＰＶ与ＭＤＰＶ ＮＳ基因比对的核苷 酸序列同源性为７９．７ ～９９．２ ，推导的氨基酸 序列同源性为９０．０ ～９８．７ 。从进化树可知 ＭＤＧＰＶ Ｄ株与其亲本强毒ＰＴ株ＮＳ基因与 ＭＤＰＶ亲缘很近。ＭＤＰＶ只感染番鸭，ＧＰＶ可同 时感染鹅和番鸭，ＭＤＧＰＶ在人工感染试验时对鹅 和番鸭均具有致病力，然而ＭＤＧＰＶ与ＭＤＰＶ ＮＳ 基因具有很高的序列同源性，这种基因重组现象有 待深入研究阐述【５］。 细小病毒属成员ＮＳ蛋白在病毒复制和转录中 扮演重要角色，在感染宿主细胞过程中发挥至关重 要的作用，并且与病毒毒力有关Ｌ６ ］。目前认为 ＮＳ蛋白结构中的核苷三磷酸结合区（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ，ＮＴＰ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ） 是产生毒力作用的主要区域。该区域氨基酸的突变 将影响解螺旋酶超家族成员的ＡＴＰ酶活性区域结 构单位ｗａｌｋｅｒ Ａ的功能，将改变病毒对宿主的细 胞毒作用。研究表明，ＡＴＰ结合结构域中甘氨酸 残基（Ｇ）对疱疹病毒的毒力有很大的影响，任何 一个氨基酸残基发生改变，则会导致ＴＫ蛋白功能 丧失而致弱ｒｌ ］。我们通过多序列比对分析发现， ＭＤＧＰＶ强、弱毒株在ＮＴＰ区ａａ”。氨基酸位点的 差异，造成亲本强毒ＰＴ株１个ＭＣＨ ｌＩ型ＣＤ４ Ｔ 细胞表位（ａａ∞。～ａａ。 ）消失，但仍保留Ｂ细胞抗 原表位功能，推测这个氨基酸残基的差异可能是 ＭＤＧＰＶ毒力强弱的决定因素之一。 本研究还发现病毒ＮＳ蛋白上Ｎ一糖基化位点 的突变，也是可能导致病毒毒力发生根本性变化的 原因。ＭＤＧＰＶ强、弱毒株在Ｎ端ａａ匏 氨基酸位 点的变异造成亲本强毒ＰＴ株另一个ＭＣＨ ＩＩ型 ＣＤ４ Ｔ细胞表位（ａａ ＂～ａａ船 ）的消失，但 ＭＤＧＰＶ—Ｄ株在此区域出现了新的ＭＣＨ Ｉ型 ＣＤ８。。细胞毒Ｔ细胞表位（ａａ ～ａａ 船），具有较强 的免疫原性；由于ａａ船 位Ｎ一糖基化位点的存在， 可以阻碍该区域ＣＤ８ ＣＴＬ表位的作用，逃避宿主 的ＣＴＬ反应，有利于病毒的大量增殖。 目前关于ＧＰＶ与ＭＤＰＶ基因组特征的研究着 重分析病毒结构蛋白基因遗传变异情况，认为 ＧＰＶ与ＭＤＰＶ同一地域不同年代病毒株，甚至亲 本强毒与细胞传代弱毒之间存在高度的基因序列保 守性，ＧＰＶ与ＭＤＰＶ之问２个功能性开放阅读框 也有较高的同源性ｒ１ 卜 ］。ＭＤＧＰＶ在ＮＳ基因上 呈现出ＭＤＰＶ的核苷酸序列特征，表明ＧＰＶ面对 感染宿主免疫压力，仍在积极进化变异之中。对 ＭＤＧＰＶ的ＮＳ蛋白质功能研究是揭示小鹅瘟致病 机理与强、弱毒株鉴别的基础。众多的生物信息学 软件的应用将为我们能够更加深入、便利地了解 ＭＤＧＰＶ承载的生物信息，也将为解释ＭＤＧＰＶ 的起源积累分子生物学相关证据。 参考文献： ［１］方定一．小鹅瘟的介绍［Ｊ］．中国兽医杂志，１９６２，（８）：１９—２０． Ｅ２］陈少莺，胡奇林，程晓霞，等．鹅细小病毒弱毒株选育的研究 ＥＪ］．中国预防兽医学报，２００２，２４（４）：２８６—２８８． ［３］ＺＡＤＯＲＩ Ｚ，ＥＲＤＥＩ Ｊ，ＫＩＳＡＲＹ Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ＥＪ］．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４，２３ （２）：３５９—３６４． Ｅ４］Ｚ ＤＯＲＩ ｚ，ＳＴＥＦＡＮＣＳＩＫ Ｒ，ＲＡＵＣＨ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｇｏｏｓｅ ａｎｄ ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ— ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ２ ＥＪ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，２１２（２）：５６２—５７３． Ｅｓ］ＳＨＡＣＫＥＬＴ０Ｎ Ｌ Ａ，Ｈ０ＥＬＺＥＲ Ｋ，ＰＡＲＲＩＳＨ Ｃ Ｒ，ｅｔ ａ１． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，８８ （１２）：３２９４—３３０ｌ＿ ［６］ＣＯＴＭＯＲＥ Ｓ Ｆ，ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮ Ｊ，Ｎ ＥＳＣＨ Ｊ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ＮＳ１ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｔｉｆ［ＡＣＣＡ］２—３ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，６９（３）：１６５２—１６６０． ［７］ＤＩＮＧ Ｃ，ＵＲＡＢＥ Ｍ。ＢＥＲＧＯＩＮ Ｍ。ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｕｎｏｎｉａ ｃｏｅｎｉａ Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＳ一１［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２，７６（１）：３３８—３４５． ［８］孔宪刚，李桂霞，刘胜旺，等．鹅细小病毒分离株ＨＧ５／８２的 分子特征分析［Ｊ］．中国病毒学，２００５，２０（１）：２８—３２． ［９３ ＫＡＴＡＲＺＹＮＡ ＤＯＭＡＮＳＫＡ－ＢＬＩＣＨＡＲＺ，ＡＮＮＡ ＪＡＣＵＫＯＷＩＣＺ， ＡＮＮＡ ＬＩＳＯＷＳＫＡ， ｅｔ ａ１． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎ ｔｕｒｋｅｙ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｆｌｏｃｋｓ ｉｎ Ｐｏｌａｎｄ ［Ｊ］．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ，２０１２，Ｉ５７（１２）：２４２５—２４３０． ３０８ 福建农业学报 第２８卷 ＥｌＯ３潘兹书，张楚瑜，丁建华，等．伪狂犬病毒胸苷激酶基因变异 引起的病毒致弱作用［Ｊ］．科学通报，２００１，４６（１６）： １３６４—１３６７． ｒ１４３ ＳＨＩＥＮ Ｊ Ｈ，ＷＡＮＧ Ｙ Ｓ，ＣＨＥＮ Ｃ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ Ａｓｉａ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅ［Ｊ］．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ， ２００８，３７（５）：４９９—５０５． ［１１］李昌主，韩先杰，邹玲，等．鸭瘟病毒ＡＶ１２２１株ＴＫ基因的 克隆与序列分析［Ｊ］．青岛农业大学学报：自然科学版， ２００７，２４（３）：１６２—１６４． ［１５］ＧＬ ＶＩＴＳ Ｒ，ＺＯＬＮＡＩ Ａ，ＳＺＡＢ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｇｅｅｓｅ（Ａｎｓｅｒ ａｎｓｅｒ ［１２３刘文波，周斌，黄兵，等．传染性喉气管炎病毒烟台株ＴＫ基 因序列测定及ＴＫ蛋白功能初步分析ＥＪ］．西北农林科技大 学学报：自然科学版，２００５，３３（１０）：７５—７９． ｄｏｍｅｓｔｉｃａ） ａｎｄ Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋｓ （Ｃａｉｒｉｎａ ｍｏｓｃｈａｔａ） ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｇｏｏｓｅ ａｎｄ Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｖｅｔ Ｈｕｎｇ，２００５，５３（１）： ［１３］ＴＡＴＡＲ—ＫＩＳ Ｔ，ＭＡＴ６ Ｔ，ＭＡＲＫＯＳ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ ｇｏｏｓｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｒＪ］．Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００４，３３（４）：４３８—４４４． ７３—８９． （责任编辑：柯文辉）
