分子克隆操作技术注意事项
一、 引物设计
1. 设计模板：基因过表达的设计模板为mRNA（根据基因名称和样品种属从NCBI查询）, 启动子（转录区域）的设计模板为基因组DNA片段（根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列），DNA甲基化分析（CpG岛，根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列）； 2. 设计软件：Vector NTI用于设计过表达引物，Vector NTI用于设计启动子（转录区域）克隆引物；Methprimer用于设计DNA甲基化分析引物（BSP, MSP）
3. 5’和3’端的酶切位点和保护性碱基
所用的载体的多克隆位点（MCS）有，所克隆的序列没有，可以同时做双酶切，我们的酶库有，价格便宜的，加了保护性碱基可以直接进行PCR产物酶切的（详情见《保护性碱基.doc》）；
二、 引物溶解
1. 引物的储液浓度为100μM, 计算加入灭菌水的量；
2. 打开管盖前，必须先12000RPM离心2min,因为引物为粉末，容易飘出; 3. 加入灭菌水溶解前，应稍微打开管盖即可，以免粉末飘出； 4. 引物溶液应-20℃保存；
5. 引物使用的工作液浓度为10μM, 需要多少稀释多少，剩余的应丢弃；
三、 PCR
1. 操作注意事项：操作前，应熟知所用PCR酶的说明书，并熟知说明书标示的
注意事项（引物、模板和酶的建议用量，变性温度及时间，延伸速度等），PCR是极为灵敏的技术，因此要决定避免交叉污染，注意冰上操作，这样可以提高扩增的特异性；
2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
3. PCR实验进行前，应考虑以下几个问题：引物的使用量，引物的反应浓度一
般为0.2-1μM；模板的用量，各种模板的建议用量参考PCR酶说明书，原则上第一次进行PCR反应时，采取中间值；
4. PCR常见问题及对策 问题 原因 对策 没有任何条带（“白板”） PCR体系中成分是否有重新进行实验 遗漏添加 没有目的条带，但有引物反应效率过低，其中原因调整引物与模板的配比，二聚体 可能是引物与模板的配一般按照PCR酶的说明比不合适，不是模板加得书的建议选择合适的引越多反应效率就越高，退物和模板的添加量，降低火温度过高，导致引物与退火温度 模板无法配对 有目的条带，但产量低 反应效率低，其中原因可调整引物与模板的配比，能是引物与模板的配比一般按照PCR酶的说明不合适，不是模板加得越书的建议选择合适的引多反应效率就越高，退火物和模板的添加量，降低温度高，导致引物与模板退火温度 结合配对不稳 有目的条带，但有其他杂反应特异性不高，其中原提高退火温度，如果目的带 因可能是引物设计存在带与杂带相距较远，产物缺陷，退火温度较低 产量可以满足下游实验需要，可不考虑重新设计引物
四、 长引物退火产生DNA双链
一般通过PCR扩增所需的DNA双链，如果DNA双链胶短（150bp以内），这可以通过合成互补长引物，并在引物两侧预留酶切后的酶切位点，通过变性退火程序即可形成互补的DNA双链，一般在制备shRNA编码框，miRNA过表达或干扰编码框时，可以采取上述策略；
五、 全基因合成
如果通过PCR技术无法获取目标DNA片段，我们一般委托DNA合成公司进行
全基因合成，只需告知我们需要合成的序列，并在序列的两侧加上克隆所需的酶切位点，服务公司合成后将克隆至克隆载体中，我们收到重组克隆载体（我们自己需要进行酶切鉴定和测序鉴定），需要利用预留的酶切位点亚克隆至我们的目标载体中，然后进行酶切鉴定和测序鉴定；
六、 琼脂凝胶电泳
1. 作用：PCR产物鉴定，酶切产物鉴定，胶回收纯化PCR或酶切产物； 2. 胶浓度：一般为1%，根据分析产物的大小选择合适的胶浓度；
3. 电压：电压高，泳动速度快，耗时短，但产热量大，容易烧胶，条带模糊，电压低，泳动速度慢，耗时长，但产热量小，条带清晰，应根据实际情况选择合适的电压；
4. 电泳缓冲液：加入电泳缓冲液的量高过胶面1厘米以上，如果进行胶回收时，必须使用新的电泳缓冲液液，这是为了避免污染（电泳槽和胶槽也需清洗干净并用超纯水润洗）和提高回收效率（旧电泳缓冲液的PH环境不利用DNA回收）；
5. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
七、 酶切
1. DNA的用量：一般使用0.5-1ug, 这样可以保证条带清晰，酶切充分；如果酶切产物中有目的条带小于250bp,使用考虑使用较多DNA进行酶切，否则目的条带不清晰；
2. 性内切酶的用量：根据酶的活性单位进行添加，一般1ul酶含10个活性国际单位，可以在1小时内充分酶切1ugDNA，一般酶的用量不能超过酶切体系的1/10体积，否则产生星活性（酶切不特异）；
3. 酶切体系：酶切总体系一般为20-30ul，体系大，可以使抑制酶切的因素稀释，但做琼脂糖凝胶电泳时需要配制较厚的胶，根据DNA的浓度和纯度选择合适的酶切体系；
4. 缓冲液：根据性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer），进行双酶切时，查询厂家提供的双酶切反应缓冲液表格即可； 5. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
八、 DNA片段纯化
1. PCR产物，酶切产物，酶修饰产物，如需进行下一步酶学操作，必须先进行纯化回收；
2. 方法：胶回收纯化试剂盒或PCR产物回收纯化试剂盒，胶回收纯化试剂盒是通用试剂盒，适用于所有情况，PCR产物回收纯化试剂盒只适用于产物中片段特异的情况，例如PCR产物特异，酶切产物大小特异，修饰酶产物； 3. 进行胶回收时注意紫外线照射时间勿超过60S，否则导致DNA片段突变； 4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
九、 去磷酸化
1. 单酶切的载体或目的片段进行连接时，它们各自在体内和体外容易进行自连，为防止自连，必须利用磷酸化酶（CIP）进行去磷酸化处理； 2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十、 磷酸化处理
1. 某些情况下，如果该片段的末端没有磷酸基团，自连是无法发生的，如需要对片段进行自连，则需要利用激酶进行磷酸化处理； 2. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十一、 DNA连接
1. 载体片段与目的片段的用量：目的片段与载体片段的摩尔比应大于3:1，小于10:1，载体片段与目的片段的总用量因大于50ng小于200ng;
2. 连接体系：总连接体系一般为10-20ul，体系小，载体片段与目的片段的碰撞几率提高，从而提高连接效率，在各种条件满足的条件下，尽量进行小体系连接；
3. 连接时间和连接温度：参考连接酶的操作指南，如果片段的两端均为粘末端，可进行室温短时间连接，如果片段的两端有一端或两端为平末端，应进行低温长时间连接；
4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十二、 感受态细胞制备
1. 感受态细胞种类：热击感受态细胞（CaCl2法），电击感受态细胞（10%甘油法）；
2. 细菌转接：复苏的细菌切勿培养超过16h，否则细菌太老了，活力极差；转接比例应控制在1:500-1:1000，这样保证后续生长的细菌的活力，转接培养体积，根据实际需要决定，但培养体积不可超过培养器皿总体积的1/3； 3. 细菌生长条件：严格按照目的细菌的生长温度，保证振荡速度不低于225RPM，这样可以保证换氧充分，生长旺盛；
4. 细菌生长密度：如果进行热击感受态细胞制备，菌液的OD600值应为0.2-0.3，肉眼观察到现象为云雾状，如果进行电击感受态细胞制备，菌液的OD600值应为0.5-0.6，肉眼观察到现象为浓云雾状；
5. 离心操作：随着离心操作次数的增加，细菌会变得越来越脆弱和松散，所以在进行吸液操作时应极为小心，在保证不吸走细菌的前提下，尽量移除上清； 6. 无菌操作：注意无菌操作，注意别离酒精灯火焰太近，否则导致细菌烫死； 7. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十三、 转化
1. 转化方法：热击转化和电击转化；
2. 注意事项：无菌操作，冰上操作，快速操作；
3. 感受态细菌与DNA（连接产物或质粒）复合时，应把DNA加入感受态细菌中，并在冰上放置一段时间，以保证DNA与感受态细菌的表面从分接触； 4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十四、 平板克隆筛选
1. 抗生素平板制备：加入抗生素时，注意培养基的温度，太高容易导致抗生素热失活，太低容易导致培养基提取凝固，从而不能进行倒板操作；为控制合适的温度，应不时摇晃瓶子，这样保证培养基的温度与瓶子表面的温度一致，用手感知瓶子表面的温度，以不烫手为宜；
2. 菌液涂布：加入合适的菌液并涂布均匀，菌液加多了，平板不易涂布均匀和干燥，加上转化效率较高，则导致菌落太密，菌液加少了，平板不易涂布均匀，加上转化效率较低，则导致菌落太稀疏，因转化效率不能提前得知，为保证成功率，可进行梯度涂板；
3. 培养条件：培养温度按照该细菌的生长温度，倒扣培养，切勿正置培养，培养时间一般不超过12-16h,否则容易长出卫星菌（细菌发生突变了），后期加
强观察，根据菌落大小随时取出，并倒扣（并用封口膜封口）放置于4℃； 4. 克隆平板从4℃取出时或后面的观察和使用操作均需保证平板倒扣放置，否则平板上的冷凝水与克隆接触，从而导致菌落交叉污染； 5. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十五、 细菌培养
1. 接种：用牙签挑取菌落（放置于4℃下超过2周的菌落不易使用）并在培养基中润洗，或用头吹打甘油菌（在-80℃下放置），然后头在培养基中润洗；培养体积不可超过培养器皿总体积的1/3；
2. 培养条件：严格按照目的细菌的生长温度，保证振荡速度不低于225RPM，这样可以保证换氧充分，生长旺盛；培养时间不要超过16小时，否则细菌老化，抗性丢失，质粒产量严重降低； 3. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十六、 质粒提取
1. 提取试剂盒：如果提取的质粒只需进行酶切鉴定，请使用OMEGA厂家或其它国产生产厂家生产的小量试剂盒即可，如果提取的质粒需进行细胞转染，请使用QIAGEN厂家生产的中量提取试剂盒，这样可以包装足够的产量和纯度（超螺旋结构，具有转染活性）；
2. 用于质粒提取的细菌的培养时间不要超过16小时；
3. 注意事项：不是用于提取质粒的菌量越多，质粒的产量就越多，因为质粒提取试剂盒的每份试剂的能力是有限的，超过每份试剂的能力，反而导致产量减低；
4. 理解掌握每步操作的原理和注意事项；
十七、 酶切鉴定
1. DNA的用量：一般使用0.5-1ug, 这样可以保证条带清晰，酶切充分；如果酶切产物中有目的条带小于250bp,使用考虑使用较多DNA进行酶切，否则目的条带不清晰；
2. 性内切酶的用量：根据酶的活性单位进行添加，一般1ul酶含10个活性国际单位，可以在1小时内充分酶切1ugDNA，一般酶的用量不能超过酶切体系
的1/10体积，否则产生星活性（酶切不特异）；
3. 酶切体系：酶切总体系一般为20-30ul，体系大，可以使抑制酶切的因素稀释，但做琼脂糖凝胶电泳时需要配制较厚的胶，根据DNA的浓度和纯度选择合适的酶切体系；
4. 缓冲液：根据性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer），进行双酶切时，查询厂家提供的双酶切反应缓冲液表格即可； 5. 理解掌握每步操作的原理和注意事项； 6. 拍照时，注意清晰度和曝光时间；
十八、 测序鉴定
1. 提供有活性的甘油菌或质粒给测序公司进行测序，如果3天内未收到测序结果，请立即询问，如果测序公司反映我们提供的甘油菌或质粒有问题，请暂时不要追究谁的问题，立即提供新的甘油菌或质粒，对于我们来说，时间才是最重要；
十九、 保存甘油菌
1. 用于质粒提取的细菌的培养时间不要超过14小时； 2. 向菌液加入灭菌处理的甘油后，应记得及时混匀； 3. 混匀好的甘油菌应放置-80℃保存，避免反复冻融；
