１３０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｏ１．３２ Ｎｏ．６ ２０１３ 影响血凝抑制试验结果的几个因素 杨国良，袁琳 ７１２０００） （渭城区动物疫病预防控制中心，陕西咸阳［中图分类号］ Ｓ ８５２．２１ ［文献标识码］Ｃ ［文章编号］ １００４—６７０４（２０１３）０６—０１３０—０１ 血凝抑制试验是兽医实验室进行免疫检测最常 用的试验方法之一。此法具有操作简便、快速、准 确、试验环境要求低、设备投入少等优点，但在实践 中常常由于某些因素的影响，会出现试验结果不准 确，甚至无法判定的情况。作者对试验中影响试验 结果的几个因素进行归纳分析，以供大家参考。 有血凝素（ＨＡ）的病毒能凝集人或动物红细 胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为 血凝抑制试验（ＨＩ）。在基层工作中血凝抑制试验 常用于新城疫、禽流感等免疫抗体的检测。现对实 验中影响试验结果的几个因素进行归纳分析，以供 大家参考。 １ 试验材料 １．１反应板的选择与清洗 微量反应板的清洗，十分重要，不洁净的反应板 会造成红细胞的非特异性凝集，影响结果的判定。 试验应选用“Ｖ”型医用血凝板，反应板孔内壁应光 滑，不能用试管刷等来刷洗Ｖ型孔。每次使用完毕 应及时冲洗孔内红细胞，自来水反复冲洗后再用 ２ ９／６的盐酸浸泡２４ ｈ以上，然后再用自来水冲洗数 次，最后用蒸馏水冲洗２～３次，在３７℃温箱中烘干 备用。如果急用可采取以下方法，将浸泡有消毒酒 精的棉签放人微量反应板的孑Ｌ内旋转后，用自来水 反复冲洗，再用蒸馏水冲洗３次以上，烘干备用。 １．２移液器的选择与使用 根据试验需要选择合适量程范围的移液器及相 匹配的吸头，忌用大量程的移液器移取小体积样品， 吸头必须安装牢固，使用时不要用力过猛，吸头浸入 液体深度要合适，角度应控制在倾斜２Ｏ。之内，保持 竖直为佳。移液前应预湿吸头，按一档吸取液体，排 出时先按一档，稍作停留再按二档排出剩余液体。 必要时可采用反向移液法，二档吸液，一档排液，将 残余液体随头弃去，这种方法精确性更高。 １．３样品的采集与处理 禽类一般采用翅静脉采血，可使用一次性采血 ［收稿日期］２０１３－０７—０１ ［作者简介］杨国良（１９６９一），男，陕西兴平人，学士，兽医师 从事动物疫病实验室诊断工作。 器或真空采血管，所采集的血液在室温下倾斜静置 ２～４ ｈ后置４℃冰箱过夜，自然析出血清；也可放人 ３７℃温箱内１～２ ｈ，１ ５００～２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ 分离血清。血清样品必须外观清亮、无杂质、无溶 血、不，必要时可做二次离心。分离出的血清样 品应在２～８℃条件下密封保存，如需贮存超过４８ ｈ 以上，应在一２Ｏ℃条件下保存。血清避免反复冻融， 实践证明反复冻融可使抗体效价降低。 ２ 红细胞 ２．１红细胞的采集 为了避免红细胞自凝现象的干扰，应采集至少 ３只ＳＰＦ公鸡或无禽流感、新城疫等抗体的健康公 鸡血（条件不足时可选用鸡场淘汰的健康公鸡）与等 量阿氏液混匀，操作时要防止凝血或溶血，使用一次 性采血器时要先抽取抗凝剂，再采血。抗凝剂加入 的时间、方法不当会产生血凝块，影响检测结果。笔 者建议使用真空管采血，操作简便快速。 ２．２红细胞悬液的制备 所采鸡血混合后加入ｐＨ７．２ ＰＢＳ液或新鲜生 理盐水１ ０００～２ ０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ ｍｉｎ，洗涤３次， 配成１ 红细胞悬液。为了充分聚集红细胞，最后 一次洗涤可采用３ ０００ｒ／ｒａｉｎ。若选用免疫过的健康 公鸡血，则要充分洗去血清和其他杂质，建议洗涤７ 次。红细胞悬液最好现配现用，４℃保存不可超过３ ｄ。使用前必须摇匀，保证每孑Ｌ加入的浓度一致。 ３ 抗原 ３．１抗原效价的测定 工作抗原在血凝抑制试验中至关重要，所以每 次试验前必须对抗原效价进行测定。抗原效价测定 不准确对试验结果有一定的影响。过高，测定的抗 体效价降低；过低，测定的抗体效价升高。为了得到 准确的抗原效价，建议试验中同时进行多排测定，取 平均滴度作为抗原的最终效价。 ３．２工作抗原的配制 根据血凝试验结果配制４ＨＡＵ的抗原，适量配 制，避免过多浪费。并进行回归试验，检查配制好的 （下转第１３１页） 畜牧兽医杂志 第３２卷 第６期 ２０１３年 １３１ 硝氯酚和三氯苯达唑两种药物驱除绵羊 肝片吸虫效果对比试验 祁 果 （海晏县青海湖乡兽医站，青海海晏８１２２ＯＯ） ［中图分类号］ Ｓ ８５２．７３５ ［文献标识码］ Ｃ ［文章编号］ １００４—６７０４（２０１３）０６—０１３１—０１ 青海湖乡地处青海湖东北部，２０１２年全乡共 苯达唑后进行草原放牧，补饲精料；２０１２年１Ｏ月２７ 存栏绵羊１４３ ５３０只，冬春在青海湖湿地放牧的绵 羊占６０ ，夏秋在青海湖湿地放牧的绵羊占３５ ， 四季草场均有湿地的占１７ ，近年来由于草场承 包，统一驱虫难度大，草原超载饲养，贩卖流动频繁， 绵羊肝片吸虫感染率呈现上升态势，统计显示２０１０ 年、２０１１年我乡死于肝片吸虫的绵羊占总死亡羊数 的３２．８ 和３５ 。为此，我们用硝氯酚和三氯苯达 唑进行了驱虫效果对比试验。 日称重Ａ组按计量投服硝氯酚，Ｂ组按计量投服三 氯苯达唑后进行全舍饲强化育肥。 ４试验结果见表１。 表Ｉ两种药物对比试验 １试验绵羊 本乡达玉日秀村一牧户（四季草场均有湿地）育肥 的１５０只不同年龄和性别的绵羊（假定为全部感染）。 ５讨论 ５．１在同等感染情况下，饲养管理条件相同，三氯 苯达唑比硝氯酚驱虫率高出１８．８个百分点，这与硝 氯酚对肝片吸虫幼虫驱除效果并不明显有关。 ５．２秋季驱虫时逢绵羊怀孕期，硝氯酚会导致部分 ２试验药物及计量 １、硝氯酚片，用量４ ｍｇ／ｋｇ体重内服。２、三氯 苯达唑片商品名肝蛭净，用量１０ ｍｇ／ｋｇ体重内服。 ３ 试验方法 将试验羊群随机分成Ａ、Ｂ两组，每组７５只，称 重后Ａ组按计量投服硝氯酚，Ｂ组按计量投服三氯 ［收稿日期］２０１３－Ｏ０一Ｏ０ ［作者简介］祁果（１９６８一），青海门源人，本科，助理兽医师， 从事畜牧兽医工作。 绵羊流产，并使泌乳量减少，但三氯苯达唑对孕畜和 泌乳无影响。 ５．３在日常工作中应加强驱虫药物种类宣传，在驱 除肝片吸虫幼虫时应选择三氯苯达唑，如在草原放 牧应在一月后进行第二次驱虫。 （上接第１３０页） 防止液体蒸发。 抗原是否达到所需标准。４ＨＡＵ抗原建议现配现 用，不宜长时间保存。用过的抗原再次使用时由于 试验因素的变化必须重新测定效价，禁忌按照前一 ５ 结果判定 整个试验应该严格按照试验要求的时问进行操 作。每次试验应设立阳性血清和阴性血清对照。只 有在阴性对照孔血清效价不大于２１ｏｇ２，阳性对照 次血凝试验结果配制工作抗原。４ＨＡＵ抗原使用 前必须充分混匀，加样时应避免接触孔内液体，可采 用从后往前的加样方式。 孑Ｌ血清误差不超过１个滴度时，试验结果才有效；同 时抗原对照孔必须凝集，稀释液对照孔不凝集，否则 试验不成立。判定结果时，可将反应板４５。倾斜，红 ４温度与时间 温度对试验的结果影响较大，呈正相关。温度 过高会使反应物解离和红细胞溶血，温度太低会使 红细胞发生自凝。同时温度影响试验的作用时间， 随着温度的升高，试验结果出现的时间变短。所以 ＨＩ试验的温度应控制在２Ｏ℃～２５℃，时间为３Ｏ～ ４０ ｍｉｎ。另外使用空调时应避免在排风口下工作， 细胞呈泪滴样流淌，泪滴长度可参照稀释液对照孔， 与稀释液对照孔泪滴长度相同的孔为ＨＩ效价。泪 滴长度会随时间变化，所以判断时应迅速。 总之，在血凝抑制试验中，每一环节都应该认真 细致，操作要规范，同时要考虑各方面的因素，发现 问题及时纠正，这样才会获得正确的试验结果。
