第２１卷第６期 化学 研究 中国科技核心期刊 ２０１０年１１月 ＣＨＥＭｌＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ｈｘｙｊ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｒｌ 天然黄酮类化合物清除羟基自由基的活性研究 王 勇 ，庆伟霞 ，杨玉霞 ，赵东保¨ （１．河南大学化学化工学院，河南开封４７５００４； ２．河南大学医学院，河南开封４７５００４） 摘要：采用分光光度法测定了黑沙蒿中黄酮类化合物清除羟基自由基的能力，以Ｉｃｓ。值作为评价指标，初步探 讨了黄酮类化合物清除羟基自由基的活性与结构之问的关系，为开发利用黑沙蒿提供了科学依据． 关键词：黄酮；羟基自由基；黑沙蒿；活性 中图分类号：０ ６５７．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８一１０１Ｉ（２０１０）０６—００５７—０３ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｘｙｌ Ｒａｄｉｃａｌｓ ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇ ，ＱＩＮＧ Ｗｅｉ—ｘｉａ ，ＹＡＮＧ Ｙｕ—ｘｉａ ，ＺＨＡｏ Ｄｏｎｇ—ｂａｏ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ ４７５００４，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ ２．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ ４７５００４，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ Ｏｒｄｏｓｉｃａ ｋｒａｓｃｈｅｎ ｉｎ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ １Ｃ５ｏ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｄｅｘ ｔｏ ｅｖａｌｕ— ａｔｅ ｔｈｅ ｓｅａＶｅｎｇｉｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｙ，ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ ｅｘｏｎｓｈｉｐｐｌｏｒｅｄ Ｔ‘． ｂｅ ｗｈｉ ｓ ｈ：， ｎ ａｏｎｐ ｅ’。ｆｈｕｙｌｌｄｙ ｉ， 。ｘｓｙ ｔｏｒａ ｄｐｉｒｃｏａｖ ｉｄａｃｅ ｉｓｖｃ［￣ｉｅ＇ｎ ｔａｉｎｆｉｄｃ ｓｔｒｕｃ－ｇｒｏｕｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ Ｏｒｄｏｓｉｃａ ｋｒａｓｃｈｅｎ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ Ｏｒｄｏｓｉｃａ ｋｒａｓｃｈｅｎ；ａｃｔｉｖｉｔｙ 羟基自由基是一种最活泼的氧自由基粒子，具有反应活性强、毒性大等特点．它可以与生物体内的多种 物质发生高效、快速的反应，导致生物机体的损伤和各种病变发生 ］．因而寻找高效低毒的清除羟基自由 基的药物已成为当今热门的研究课题之一ｌ２ ］．天然黄酮类化合物广泛存在于自然界，因其具有较强的还原 性和极小的毒副作用 ］而受到人们的广泛关注．本文作者采用分光光度法研究了从黑沙蒿中提取分离出 的黄酮类化合物［６ 对羟基自由基的清除作用，并对其构效关系进行了探讨，以期找到高效、无毒的抗羟基自 由基的化合物，为进一步开发利用黄酮类化合物提供参考． １ 实验部分 １．１仪器与试剂 ７５５０紫外分光光度仪（上海分析仪器厂），酸度计（上海大中分析仪器厂），电热恒温水浴锅（北京光明医 疗仪器厂）．三羟甲基氨基甲烷（中国惠兴生化试剂有限公司），甲基紫，硫酸亚铁，Ｈ Ｏ （３０％），无水乙醇． 黄酮类化合物（结构见图１），分别用无水乙醇配制成溶液，用时稀释至合适浓度． 收稿日期：２０１０—０７—１９． 基金项目：河南省科技厅国际合作项目（０８４３００５１００２）． 作者简介：王勇（１９７９一），男，讲师，从事天然产物化学研究．Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｏｎｇ：＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ． 通讯联系人 ５８ 化学研究 Ｒ３ Ｒ４ ０Ｈ ｏ １＿Ｒ１一ＯＣＨ３，Ｒ２一Ｈ，Ｒ３＝Ｈ，Ｒ４＝ＯＣＨ３，Ｒ５＝Ｈ； ２．Ｒｌ—ＯＨ，Ｒ２一ＯＣＨ３，Ｒ３一Ｈ，Ｒ４一ＯＣＨ３，Ｒ５一Ｈ； ３．Ｒｌ—ＯＨ，Ｒ２一Ｈ，Ｒ３一ＯＣＨ ３，Ｒ４—０ＣＨ３，Ｒ５一Ｈ； ４．Ｒ１—０ＣＨ３，Ｒ２一Ｈ，Ｒ３一ＯＨ，Ｒ４一ＯＨ，Ｒ５一Ｈ； ５．Ｒ１一ＯＨ，Ｒ２一ＯＣＨ。，Ｒ３—０Ｈ，Ｒ 一０ＣＨ。，Ｒ５—０Ｈ 图１ 黑沙禹中黄酮类化合物的结构式 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ Ｏｒｄｏｓｉｃａ ｋｒａｓｅｈｅｎ １．２实验方法 在一系列１０ ｍＬ比色管中依次加入１．０ ｍＩ 甲基紫溶液（２．０×１０ ｔｏｏｌ・Ｉ ）、１．０ ｍＩ Ｆｅ 溶液（１＿０ ×１０ ｔｏｏｌ・Ｉ ）、１．０ ｍＩ Ｈ２Ｏ （Ｏ．１２％）溶液，用Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液调节ｐＨ ４．５后稀释到１Ｏ ｍＬ，摇匀， 放置３０ ｒａｉｎ，测定５７８ ｎｍ处吸光度Ａ。，甲基紫和Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液做空白溶液测定吸光度值为Ａ，两者均 以水为参比，测定样品时在上述体系中预先加入１．０ ｍＩ 样品溶液，测定吸光度值Ａ ，同体积样品溶液、 Ｔｒｉｓ—ＨＣ１和水溶液作参比，清除率计算公式为：Ｓ一［（Ａ 一Ａ。）／（Ａ—Ａ。）］×１００％．以清除率ｓ对各样品 的浓度进行回归处理，得工作曲线Ｓ：ａｚ＋ｂ，式中－ｚ是各样品的终浓度，由此可计算出各样品的Ｉｃｓｏ值． ２结果与讨论 ２．１ ，在５７８ ｎｍ处有强吸收．过氧化氢与催化剂Ｆｅ抖发生Ｆｅｎｔｏｎ反应： Ｆｅ抖＋Ｈ Ｏ。一Ｆｅ抖＋０Ｈ～＋・ＯＨ，产生的・ＯＨ具有高的反应活性，会与甲基紫中具有高电子云密度的 ｃ—Ｃ一基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色．通过测定甲基紫在５７８ ｎｍ处吸光度的变化可间接测定 出・ＯＨ的生成量．当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与・ＯＨ的反应，从而使得甲基紫的颜色有 所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度的变化来评价物质的抗氧化性强弱． ２．２加样顺序的考察 固定甲基紫、Ｆｅ计、Ｈ Ｏ 和样品的浓度，考察了三种加样方式对吸光度的影响，结果见表１． 表ｌ 加样顺序对吸光度的影响 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｏｒｄｅｒ ｔＯ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ 备注：Ａ：甲基紫的吸光度（未加Ｆｅｎｔｏｎ试剂及样品）；Ａ。：甲基紫ｑ－Ｆｅｎｔｏｎ试剂的吸光度（未加样品）； Ａ ：样品＋甲基紫＋Ｆｅｎｔｏｎ试剂的吸光度（加入样品）；原理上Ａ＞Ａ ＞Ａｏ 第６期 王勇等：天然黄酮类化合物清除羟基自由基的活性研究 ５９ ２．３黄酮类化合物清除羟基自由基的构效关系 五种天然黄酮类化合物清除羟基自由基的作用能力不同，其结果见表２．这种差异与它们本身的结构有 关．从表２数据并结合样品的结构可得出以下结论：（１）五种能清除羟基自由基的黄酮类化合物都具有酚羟 基结构，提示酚羟基是清除羟基自由基的主要活性基团．并且通过比较样品１和其他样品清除羟基自由基 的１Ｃ 。值，可以看出分子中所含酚羟基数目越多，对羟基自由基的清除能力越强．（２）化合物２和３分子中 羟基数目和取代位置相同，但一ＯＣＨ。取代位置不尽相同：化合物２中一ＯＣＨ。在６和４ 位；化合物３中－ＯＣＨ。 在３ 和４ 位；但其清除羟基自由基的能力相同，说明对于羟基自由基来说，一ＯＣＨ。并不是活性部位，其所处 的位置对黄酮类化合物清除羟基自由基的活性无影响． 表２不同样品清除羟基自由基的ＩＣ 。 Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｈａｌｆ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ ３ 结论 采用分光光度法研究了黑沙蒿中黄酮类化合物清除羟基自由基的活性，并以Ｉｑ。值作为评价指标，初步 探讨了黄酮类化合物清除羟基自由基的活性与结构之间的关系．实验结果表明：黄酮类化合物清除羟基自 由基的活性主要取决于化合物中羟基的数目，羟基数目越多，活性越强；而一ＯＣＨ。的取代位置及数目对黄酮 类化合物清除羟基自由基的活性影响较小． 参考文献： ［１ ３ Ｅｍｒａｈ Ｋ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｂｙ ｉｔｓ ａｄｄｕｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｅｌｅｃｔｒｏ— ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＪ３．Ｔａｌａｎｔａ，２００５，６５（４）：８７６—８８１． ［２］张春生，方玉梅，王毅红，等．野生鱼腥草黄酮化合物对羟基自由基的清除作用［Ｊ］．食品科技，２００９，３４（６）：１８８—１９０． ［３］尹艳，高文宏，于淑娟，等．水溶性大豆多糖对羟基自由基抑制作用的研究［Ｊ］．食品工业科技，２００９，３０（８）：８３—８４． ［４］张晓丹，刘琳，贾绍华．桂竹糖芥黄酮总苷的抗心律失常作用及其急性毒性研究［Ｊ］．中草药，２００４，３５（１１）：１２７２— １２７４． ［５］李冬梅，尹晓飞，蔡大伟．淫羊藿总黄酮急性毒性试验研究［Ｊ］．中国药师，２００７，１０（１０）：１０１１—１０１２． ［６］赵东保，杨玉霞，张卫，等．黑沙蒿黄酮类化学成分研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０（１８）：１４３Ｏ一１４３２． ［７］朱兴松．甲基紫光度法测定Ｆｅｎｔｏｎ体系中产生的羟自由基［Ｊ］．哈尔滨商业大学学报：自然科学版．２００３，１９（５）：５９２— ５９４．
