荧光素及中性红染料间能量转移机理研究及其分析应用

荧光素及中性红染料间能量转移机理研究及其分析应用

姓名：张彦青申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：刘保生

20090601

摘要摘要荧光共振能量转移是一种通过荧光物质间发生荧光能量传递进行分析的实验方法。能量转移的应用与单个染料光度测定相比，具有比光度法灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰少，重现性好的特点，该方法已被广泛应用于化学分析、生物结构研究等领域。本文就此类方法进行了初步的机理研究及其相关应用研究，共分以下五部分：第一章：对近年来荧光素类酸性染料及碱性染料中性红在荧光分析中的应用和染料间非辐射荧光共振能量转移的机理研究及在分析化学中的应用进行了较全面的综述，共引用参考文献６２篇。第二章：应用荧光光谱法研究了水溶液体系中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）、四碘荧光素（ＴＩＦ）、四氯四碘荧光素（ＴＣＴＩＦ）、四氯四溴荧光素（ＴＣＴＢＦ）分别与碱性染料中性红（ＮＲ）之间的相互作用。实验表明：ＮＲ对各酸性染料的荧光都有较强的猝灭作用，由荧光猝灭结果求得不同温度下ＮＲ与各种酸性染料的结合常数Ｋ。发现Ｋ值随反应温度上升而下降且随酸性染料取代基的电负性增加而增大，进一步证实了该反应为单一静态猝灭过程。由反应焓变、熵变，确定ＮＲ与酸性染料间的结合力主要是静电引力。依据非辐射能量转移机理，得到了不同温度下各酸性染料与ＮＲ相互结合时，能量转移效率、能量给体与能量受体间距离ｒ等参数，各体系ｒ＜７ｍ表明该荧光猝灭是通过非辐射能量转移过程产生的。并发现随着染料取代基的电负性增加，能量转移参数的一些变化规律。第三章：四溴荧光素一中性红荧光能量转移抑制法测定肝素。在ｐＨ６．６５的Ｂｒｉｔｔｏｎ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（Ｂ．Ｒ）缓冲溶液中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）与碱性染料中性红（ＮＲ）之间由于静电吸引而能够发生有效的能量转移，使得能量受体ＮＲ荧光增强，同时能量给体ＴＢＦ的荧光猝灭。而肝素的加入对该荧光体系间的能量转移产生了明显的抑制作用，随肝素量的增加ＴＢＦ荧光依次增强，即能量转移过程受到抑制而发生逆转，由此建立了一种测定微量肝素的新方法。结果表明，肝素在Ｏ．１～２．０ｍ∥Ｌ范围内与ＴＢＦ的荧光增强程度呈良好的线性关系，方法检出限Ｏ．０７１ｍ∥Ｌ。该方法用于肝素钠注射液中肝素钠效价的测定，六次平行测定相对标准偏差１．３９％～３．５９％，回收率９５．２％～１０５．３摘要％，结果满意。第四章：四溴荧光素一中性红逆向能量转移荧光法测定蛋白质。在ｐＨ２．３５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）与碱性染料中性红（ＮＲ）之间由于静电吸引能够发生有效的能量转移，使能量受体ＮＲ荧光增强，能量给体ＴＢＦ的荧光猝灭。在该体系中加入人血清白蛋白（ＨＳＡ），由于竞争作用使得ＨＳＡ的加入破坏了ＴＢＦ－ＮＲ间的能量转移，产生了明显的逆向反应，并且生成ＨＳＡ．ＴＢＦ络合物，利用该络合物的荧光增加强度与ＨＳＡ含量间的线性关系建立了一种测定微量血清蛋白的新方法。结果表明，血清蛋白的测定范围０．６一１２．０ｍ∥Ｌ；方法检出限０．２５ｍ∥Ｌ；六次平行测定相对标准偏差１．９４％～４．５８％；回收率９６．３％～１０４．９％。方法的稳定性好，选择性高，直接用于人血清试样中总蛋白含量的测定，与常用的双缩脲法基本一致。第五章：胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究。研究了阳离子表面活性剂（ＣＳＡＡ）溴代十六烷基三甲铵（ＣＴＭＡＢ）及溴代十六烷基吡啶（ＣＰＢ）在水溶液中与阴离子酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）的荧光反应，发现当ＣＳＡＡ单体与ＴＢＦ形成离子缔合物时，ＴＢＦ的荧光发生猝灭，而随着ＣＳＡＡ胶束与ＴＢＦ继续作用又会产生一个新的、更强的荧光。进而研究了阳离子表面活性剂ＣＴＭＡＢ及ＣＰＢ胶束体系中酸性阴离子荧光染料荧光素与ＴＢＦ问的能量转移条件。结果表明只有在带相反电荷的阳离子表面活性剂形成的胶束环境中，阴离子染料间的能量转移才可能发生，且在２／３临界胶束浓度（ＣＭｃ）时能量转移效率达到最大。并推测了胶束体系中染料间能量转移模型及染料问能量转移的一般规律。关键词荧光能量转移机理及应用抑制逆向肝素蛋白质ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎ鹕ｙ仃ａｎｓ衔ｉｓａ１１ａＩｌａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｍａｔｉｓｂａｓｅｄａｏｎｅ１１ｅ唱ｙ仃ａｎｓｆ打ｂｅｔｗｅｅｎｎｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．Ｉｎｃｏｍｐａｄｓｏｎｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｄｙｅ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｈ嬲ｈｉｇｈｅｒｓｅｎｓｉｔｉＶｉｔｙｔｈａｎｔｈｅｌｕｍｉｎｏｓｉｔｙｍｅ血ｏｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅｔｈｏｄａＩｌｄｒｅｓｏｎａｌｌｃｅ１ｉ曲ｔｓｃａｔｔ嘶ｎｇｍｅｔｈｏｄ，ｍｅｍｅｔｈｏｄｉｓＣｈａｒａｃｔ嘶ｚｅｓｄｂｙｆｅｗｉｎｆ酬ｎｇｓｕｂｓｔａＩｌｃｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ．ｇｏｏｄＴ１１ｉｓｒ印ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ｎｐ印ｅｒｉｓａｐｐｌｉｅｄｔ０ｍｅｃｈｅｍｉｃａｌａＩｌａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｏｎｂｉｏｌｏ百ｃａｌｈａｓｃａｒｒｉｅｄｍｅｓｔｕｄｙａｂｏｕｔｍｅｍｅｃｈａｌｌｉｓｍａＩｌｄｒｅｌａｔｅｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒｃｏｎｓｉｓｔｓｏｆｆｉＶｅｃｈａｐｔｅｒｓ：Ｃｈａｐｔｅｒｏｎｅ：ｎｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅ印ｐｌｉｃａｔｉｏｎａＩｌｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｎｏｎ—ｍｄｉａｔｉｏｎａｌｓｏｅｎｅｒｇｙ仃ａｎｓ衔ｏｆａｃｉｄｉｔｙｄｙｅｓｔｕｆｒｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎａＩｌｄｂａｓｉｃｄｙｅｓｔｌｌ最Ｗｅｓｕｎ皿撕ｚｅｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｎａｎａｌ如ｃａｌｃｈ锄ｉｓｔⅨｗｉｍｒｅａｃｔｉｏｎｓ６２ｌｉｔｅｒａｔｌｌＩ。ｅｓｃｉｔｅｄ．ｂａＳｉｃｄｙｅｓｔｕｆｆｎｅｕｔｒａｌＣｈａｐｔｅｒ俩ｏ：Ｔｈｅｄｙｅｓｔｕｆｒｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｅ研ｅｅＩｌｒｅｄ（ＮＲ）ａＩｌｄＶ撕ｏｕｓａｃｉｄｉｔｙｔｅｔｒａｂｍｍｏｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＢＦ），ｔ酏ｒａｉｏｄｏｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＴＩＦ），ｔｅｔ】眦１１１０ｒｏｔ劬ｒ习卜ｉｎＶｅｓｔｉｇａ—ｉｏｄｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｅｎ（ＴＣＴＩＦ），ａｎｄｔｅ们ｃｈｌｏｒｏｔｅｔＩ．ａｂｒｏｍｏｎｕｏｒｅｓｃｉｅＩｌ（ＴＣＴＢＦ）ｈａＶｅｂｅｅｌｌｅｘｐ碰ｍｅＩｌｔａｌｔｅｄｂｙｔｈｅｍｅａｌｌｓｏｆｎｕｏｒｅＳｃｅＩｌＣｅｓｐｅｃ仃ａ．ＴｈｅｑｕｅＩｌｃｈｅｄｔｈｅｎｕｏｒｅｓｃｅｌｌｃｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＮＲｓ缸．０ｎ舀ｙＶ撕ｏｕｓｓｔｕｄｉｅｄａｃｉｄｉｔｙｄｙｅｓｔｕ仃，ａ１１ｄｔｈｉｓｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｑｕｅｎＣｈｉｎｇＣ０ｕｌｄｂｅｉｎｔｅ叩ｒｅｔｅｄｉｎｔｅｎ：ｌｌｓｏｆｓｔａｔｉｃｑｕｅｌｌｃｌｌｉｎｇ．ＦｒｏｍｔｈｅｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｃｏｎｓｔａＩｌｔｓＫ南ｒｔｈｅｓｅｄｙｅｓａｔＶ撕ｏｕｓｔ锄ｐｅｒａｔＩｌｒｅｓ，ｉｔｃｏｕｌｄｂｅｆｏｕｎｄｍａｔｔｈｅｉｎｃｒｅａＬｓｅａｎｉＩｌｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｅｇａｔｉＶｉｔｙｏｆｓｕｂｓｔｉｔｌｌｔｉｎｇｇｒｏｕｐＫ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＮｅｕｔｒａｌｍｄａｌｌｄｗａｓｏｆｄｙｅｓｍｏｌｅｃｕｌｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｌｅｄｔｏａｉｎｃｒｅａｓｅｉＩｌｔ锄ｐｅｒａｈｌｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｉＩｌＫ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔ、）Ｉ，‘ｅｅｎｔｏｓｔａｔｉｃ—ｅｌｅｃｔｒｉＣｉｔｙｇｒａＶｉｔａｔｉｏｎｗｈｉｃｈｖ撕ｏｕｓａｃｉｄｉｔ）ｒｄｙｅｓｔｌｌ凰ｗｅｒｅａｔｔｒｆｂｕｔｅｄｃｏｎｆｉｍｅｄｂｙｍｅｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｎｔｈａｌｐｙａｎｄｅＩｌ仃ｏｐｙｆｏｒｔｌｌｅｓｅｒｅａＣｔｉｏｌｌｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｅｎｏｎ—ｒａｄｉａｔｉｏｎｅ１１鹕ｙｔｒｍｓｆ打ｍｅｏ巧，ｔｌｌｅａｃｃ印ｔｏｒ．ｄｏｎｏｒｄｉｓｔａｎｃｅＳ（ｒ）ａｎｄａｎｄｅＩｌｅ嗡，仃ａｎｓ衔ｅ衔ｃｉｅＩｌＣｉｅｓｂｅｔ、）ｌｒｅ饥ＮＲＶ撕ｏｕｓａｃｉｄ竹ｄｙｅｓｔｕｆｆａｔＶ撕ｏｕｓｔ锄ｐ蹦岫Ｄｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｍｒｔｈｅｒｓｕｐｐｏｒｔｅｄｔ１１ｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｔｈａｔｉｆｒｗａｓｗｉｔｌ：ｌｉｎ７ｎｍ，ｍｅｓｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｔｈｅｓｉｎ舀ｅＳｔａｔｉｃｑｕｅｌｌｃｌｌｉｎｇｗｈｉｃｈｗａＳｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｎｏｎ－ｒａＩｍａｔｉｏｎｅ１１ｅ哟，仃ａ１１ｓ砌：ＩｔＣｏｕｌｄｂｅｆｏｕｎｄｓｏｍｅｒｅｇｕｌ砸ｔｙ锄ｏｎｇｍｅｐ聪衄ｅｔｅｆｓｏｆｅｎｅ嘲，缸独ｓ向ａｌｏｎｇｗｉｍｔ１１ｅｉｎｃｒｅａＳｅｉｎｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｅｇａｔｉＶｉｔ）ｒｏｆｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｎｇｇｒｏｕｐｏｆｄｙｅＳ．ＩｌＩＡｂｓｔｒａｃｔＣｈａｐｔｅｒｍｒｅｅ：Ｔｅｔｒａｂｒｏｍｏｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｎｅｒｇｙ仃｛ｍｓｆ打ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｎＩｌｉｎａｔｉｏｎｏｆｈ印ａｒｉｎ．ＩｌｌｔｈｅＢｎｔｔｏｎ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（Ｂ—Ｒ）ｂｕｆｆ打ｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｆｐＨ６．６５，ｔ１１ｅｅ毹ｃｔｉＶｅｅｎ吣ｙｔｒａｌｌｌｓ衔Ｃ０ｕｌｄｏｃｃｕｒｂ咖ｅｅＩｌＴＢＦａＩｌｄＮＲ．ＴｌｌｅａｔｔｈｅｎｕｏｒｃｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆＴＢＦｗａｓｒｅｄｕｃｅｄａＩｌｄｔｈａｔｏｆＮＲｗａｓｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄｓ锄ｅｔｉｍｅ．Ｂｕｔｉｆｔｈｅｈ印撕ｎｗａｓａｄｄｅｄｔ０ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍ，彻ｎａｒｋａｂｌｅｉＩｌｌｌｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍｅｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｅｎｅ唱ｙ衄ｌｓ衔ｏｆＴＢＦ－ＮＲｐａｉｒｗ嬲ｄｅｔｅｃｔｅｄａ１１ｄｔｈｅｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆＴＢＦｗａｓｓ订ｅｎ舀ｈｅｎｃｄ．Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆ．ｏｒｔｈｅｄｅｔｅｍｌｉｎａｔｉｏｎｏｆ缸ａｃｅｈ印撕ｎｗａｓｄｅＶｅｌｏｐｅｄｂｙｕｓｉｎｇｅｎｅ唱ｙ仃觚ｓｆ旨五吣ｍｌｉｎｅａｒＴＢＦｔ０ＮＲ．Ｔｌｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｌｌｌｉｔｏｆｔｌｌｉｓｍｅｔｈｏｄｗ嬲０．０７ｌｄｅｔｅｎｒｌｉｎａｔｉｏｎｆｏｒｍ∥Ｌ．Ｔｈｅｍｇｅｏｆｈ印ａｒｉｎｗａｓＯ．１～２．０ｍ∥Ｌ．Ａｍｏｎｇｓｉｘｔｉｍｅｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａＩｌｄａｒｄｄｅＶｉａｔｉｏｎｗａｓ１．３９％一３．５９％ａ１１ｄｍｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅＳｗｅｒｅ９５．２％～１０５．３％．ＴｈｅｍｅｍｏｄｈａｓｂｅｅＩｌａｐｐｌｉｅｄｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ．ｄｅｔｅ肌ｉｎａｔｉｏｎｏ仆印撕ｎｓｏｄｉ啪ｉｎ岫ｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｓａｔｉｓｆａｃｔｏＤ，Ｃｈａｐｔｅｒｆｏｕｒ：ＤｅｔＩｅｎｎｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉＩｌｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｅ行ｅｃｔｉＶｅｒｅＶｅｒｓｅｔｅ“ｂｒｏｍｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ．ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄｅＩｌｅｒｇｙ缸ａＩｌｓｆ；瓯ＩＩｌｍｅＢｒｉｔｔｏｎ—Ｒｏｂｉｎｓｏｎｂｕ丘ＩｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｆｐＨ２．３５，ｎｅｕｔｌ协ｌｅＩｌｅｒｇｙ仃ａＩｌｓ向ＣｏｕｌｄｏｃｃｗｂｅＭｅ饥ｔｅ仃．ａｂｒｏｍｏｎｕｏｒｅｓｃｅｉＩｌ（ＴＢＦ）ａｎｄｔ０ｓｔａｔｉｃａｎｒａＣｔｉｏｎ．１１１ｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｄ州Ｒ）ｄｕｅｉｎｔｅｎｓｉ够ｏｆＴＢＦｗ嬲ｒｅｄｕｃｅｄａｎｄｔｈａｔｏｆｓｅｎＨｎＮＲｗ嬲ｉＩｌｃｒｅａＳｅｄａｔｔｌｌｅｓ锄ｅｔｉＩＩｌｅ．ＷｈｅＩｌｈ啪ａＩｌａｌｂ啪ｉｎ（ＨＳＡ）ｗ嬲ａｄｄｅｄｉｓｔｏｍｉｓｓｙｓｔ锄，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｌｌｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｅＩｌｅ理；ｙｏｃｃｕｒｔｒａＩｌｓ衙ｂｅｔｗｅｅｎＴＢＦ－ＮＲｐａｉｒｄｉｓ劬ｅｄ，ｃａｕｓｉｎｇａＩｌｄｒｅＶｅｒｓｅｗｉｔｌｌｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｔｈｅｉｎｃｒｅａＳｅｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｌｌｃｅｉｎｔｅＩｌｓ时ｏｆＴＢＦｆ０珊ａｔｉｏｎｏｆＨＳＡ—ＴＢＦｃｏｏｒｄｉｎａｔｅＣ０ｍｐｏｕｎｄ．Ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｌｌｅｄｅｔｅｎ】［１ｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｒａｃｅＨＳＡｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｍｅｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔ、）ｌ，ｅｅＩｌｔｌｌｅｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｉｌｌｔｅＩｌｓｉｔｙｏｆｍｅｃｏｏｒｄｉｎａｔｅＣ０ｍｐｏｕｎｄａｎｄｃｏｎｃ黜【仃ａｔｉｏｎｏｆＨＳＡ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆｔｈｉｓｍｅｍｏｄｗａＳＯ．２５ｍ∥Ｌ．Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｍｇｅｏｆｄ酏ｅｍｌｉｎａｔｉｏｎｆｏｒＨＳＡｗａＳ０．６～ｌ２．Ｏｍ∥Ｌ．ＡｍｏｎｇｓｉｘｐａｒａｌｌｅｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳ，ⅡｌｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａＩｌｉｌａｒｄｉｌｅＶｉａｔｉｏｎｗａＳ１．９４％～４．５８％ａＩｌｄｔｈｅｒｅＣｏｖｅｒｉｅｓｗｅｒｅ９６．３％～ｌ０４．９％．ＴｈｅｍｅｔｌｌｏｄｗａＳｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙｇｏｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙａＩｌｄｈｉｇｈｓｅｌｅｃｔｉｖｉ吼Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍ锄ｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｃｓｗｅｒｅＶｅ巧ｃｌｏｓｅｔｏｎｌｏｓｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇｂｉｕｒｅｔｓｐｅＣ缸Ｄｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｃｈ印ｔｅｒｆｉＶｅ：ＴｈｅｓｍｄｙｏｎｅｎｅＦｇｙ仃ａｎｓ缸’ｍｅｃｈａＪｌｉｓｍｂｅ帆ｅ锄ｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩＶｓｏｄｉｕｍａｎｄＡｂｓｔｍｃｔｔｅ眈ｂｒｏｍｏｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｏｄｉｕｍｉＩｌＩＩｌｉｃｅｌｌｅｓｏｆｃａｔｉｏＩｌｉｃｓｕｒｆａｃｅａｃｔｉｖｅａｇｅＩｌｔ．ｈｌⅡｌｉｓｐａｐ％ｍｅ日ｕｏｒｃｓｃｅＩｌｃｃｒｅａｃｔｉｏｎｏｆｃａｔｉｏＩｌｉｃｓｕｒｆａｃｅａｃｔｉＶｅａｇｅｎｔｓ（ＣＳＡＡ）：ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｌｌｙｌ锄ｍｏｌｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＭＡＢ）ｏｒｈｅｘａｄｅＣｙｌｐｙｒｉｄｉＩｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＰＢ）ｗｉｔｌｌｔｅ纽ａｂｒｏｍｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｏｄｉｕｍ（ＴＢＦ）ｉＩｌａｑｕｅｏｌｌｓｓｏｌｕｔｉｏｎｗ硒ｉｎＶｅｓｔｉｇａｔｅｄ．ＩｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｑｕｅｎｃｌｌｉｎｇｏｆＴＢＦ印ｐｅａｒｅｄｗｈｅｎｉｔｒｅａＣｔｅｄｗｉｍｍｅｃａｔｉｏｎｍｏｎｏｍｅｒｏｆａＣＳＡＡａＩｌｄａｎｅｗｓ缸．ｏｎｇｅｒｎｕ‘）ｒ贫ｃｅｎｃｅｗ弱ｏｂｔａｉｎｅｄｗｈ饥ｔｌｌｅｉｏｎ．ａＳｓｏｃｉａｔｅｓｒｅａｃｔｗｉｎｌｔｈｅｍｉｃｅｌｌａｔｅｏｆＣＳＡＡ．Ｗｂｉｎｖ髓ｔｉｇａｔｅｄｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｅＩｌｅｒｇｙ仃ａＩｌｓｆ打ｂｅ咐ｅｅＩｌａｃｉｄｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ（ｂ，ｅｓｉｎｍｉｃｅｌｌｅｓｏｆｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｍｙｌａｍｍｏＩｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ０ｒＨｅｘａｄｅｃｙｌｐ妒ｄｉｍ眦ｌｂｒｏｍｉｄｅ．ＩｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｉｎｍｅｍｉｃｅｌｌｅｓｗｈｉｃｈｗｅｒｃｆｏｍｅｄｂｙｃａｔｉｏＩｌｉｃ耐．ａｃｅａ以ｖｅａｇｅｎｔｗｉｔｈｄｙｃｓｅｌｌｌｂｅｄｄｅｄ（ｃａｔｉ砌ｃｇｕｍＣｅａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔａｎｄｄｙｅｓｗｅｒｅｏｆｏｐｐｏＳｉｔｅｃｈａｒｇｅ），ｗｈｅｎｔｌｌｅｃｏｎｃｅｎ臼．ａｔｉｏｎｏｆ∞ｔｉｏＩｌｉｃｓｕｌＩｆ．ａｃｅａｃｔｉＶｅａｇｅｎｔｒｅａｃｈｅｄｔｏａｃｅｒｔａｉｌｌｖａｌｕｅ，ｍｅｅＩｌｅｒｇｙ仃ａ１１ｓｆ．ｅｒｃｏｕｌｄｏｃｃｌｌｒ．ｈｔｌｌｅＶａｌｕｅｏｆ咖ｔ１１ｉｒｄｓｏｆ砸ｔｉｃａｌＩＩｌｉｃｅｌｌｅＣ０ｎｃｅ删ｏｎ（ＣＭＣ），ｍｅｅ雎ｃｉｅＩｌｃｙｏｆｅｎｅ啊仕ａｎｓ向ｒｅａｃｈｅｄⅡｌｅｍａ】【咖；ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃ删ｉｏｎｏｆｃ撕０１１ｉｃ鲫渤ｃｅａ鲥ｖｅａｇｅＩｌｔｗｅｎｔ０ｎ栅ｃｒｃ嬲ｉＩｌ岛ｔｌｌｅｅｆ！ｆｉｃｉｅＩｌｃｙｏｆ胁ｅｒ盱仃ａＩｌｓｆ醯ｗｏｕｌｄｂｅｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＷｅａｌＳｏｄｅｄｕＣｅｄ也ｅｍｏｄｅｌｏｆｅＩｌ锄ｇｙ仃ａ１１ｓｆ打ｂｅ咐ｅｃＩｌｄｙ．ｅＳｉＩｌｍｉｃｅｌｌｅｓａＩｌｄｌａｗｓｏｆｉｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｆ１ｕｏｒ懿ｃｅｎｃｅｅ１１％ｇ）ｒ饥ｍｓｆ醯ＭｅｃｈａＩｌｉｓｍａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＩｎｌｌｉｂｉｔｉｏｎＲｅＶｅｒｓｅＨ印撕ｎＰｒｏｔｅｉＩｌＶ河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文及取得的研究成果。尽我所知，中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：丞签壹日期：ｊ塑Ｌ年—厶月上日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于ｌ、保密口，在——年——月——日解密后适用本授权声明。２、不保密酣。（请在以上相应方格内打“√’’）的学位论文，是我个人在导师（老阮琵）指导并与导师合作下取得的研究成果，本人为申请河北大学学位所提交的题目为ｃ藿霪錾奏塞葬鼎学保护知识产权声明研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行规以及河北大学的相关规定。本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人：么趁高日期：ｊ垒Ｌ年—厶月卫日作者签名：导师签名：日期：２翌２年—厶月—』Ｌ日日期：翻年—厶月上日第１章综述第１章综述荧光素类染料及中性红在荧光分析中的应用摘要：对近年来荧光素类酸性染料及碱性染料中性红在荧光分析中的应用和染料间非辐射荧光共振能量转移的机理研究及在分析化学中的应用进行了较全面的综述，共引用参考文献６２篇。关键词：酸性染料；碱性染料；能量转移；荧光分析１．１荧光素类染料在荧光分析中的应用大约在１８７１年或稍早，ＢａＴＢＦｅｒ合成出了荧光素、酚酞及涪因等染料。１８７７年，ＢａＴＢＦｅｒ将１０ｋｇ的荧光素倾人多瑙河的源头，来跟踪多瑙河与莱茵河的联系。６０ｈ后，在一个与多瑙河无明显联系的小河里，看到了荧光素的特征荧光，因小河在汇人ＣｏｎｓｔａＩｌＣｃ湖以后流人莱茵河，这样就证实了多瑙河与莱茵河的相连。直到现在，跟踪水域仍是荧光素的一个应用。欧洲光化合会用它来跟踪分析污染物在水域中的流向。基于这类分子很强的荧光发射能力及其发光特性随环境而变化的特征，荧光素及其衍生物在生物学和医学上有极为重要的应用，是一类最常用的荧光探针和诊断试剂。荧光素类染料用途很广，既可作为荧光染料，又可利用它们和金属离子的配位性质，实现对金属离子的检测。近年来，荧光免疫技术的发展，发光标记物或探针的选择成为免疫检测成败的关键，所以荧光探针性质的研究引起人们更多的关注。荧光素类化合物作为广泛应用的标记物，优点是荧光量子产率高，发射波长较长，背景干扰小，缺点是Ｓｔｏｋｅｓ位移小，对样品散射光敏感。ＨｏＡＢ图１．１Ｆｉｇ．１－ｌ荧光素类染料的结构Ｔｌｌｅｓ仃ｕｃｎ珊ｏｆｎｕｏｒｅＳｃｅｉｎｅｓ河北人’≯珲学硕十学何论文荧光素类染料是一类经典的阴离子酸性荧光染料，常用荧光素类染料结构见图１．１。由于氧桥键的作用把两个苯环固定在一个平面上，使分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能够产生强烈的荧光，且荧光激发和发射波长均在可见光区，具有较高的荧光量子产率。用于测定具有选择性高、稳定性好和灵敏度高的优点，其在荧光分析中得到广泛应用，见表１．１。表１．１１．ａｂ１－１荧光素类染料在荧光分析中的应用Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｏｒｅｓｃ咖ｉｎｎｕｏｒｅｓｃｅｌｌｔａｎａｌｙＳｉｓ第１章综述１．２中性红染料在荧光分析中的应用中性红（Ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄ，简称ＮＲ）是一种常见的生物染料和光谱探针，属于阳离子碱性荧光染料，具有平面共轭芳香结构，见图１．２。在酸性溶液中具有一定的荧光强度，是一３－河：｜匕大学理’≯硕十学位论文一类良好的荧光试剂，同时可作为ＲＮＡ等生物大分子的嵌入体，以协同方式与ＩⅢＡ分子发生键合，具有较好的生物活性【２引，应用广泛，其在荧光分析中的应用见表１．２。Ｎ彩Ｎ（Ｈ３ｃ）２Ｎ图１．２中性红结构Ｆｉｇ．１－２Ｔｈｅｓｔｎｌｃｔｕ他ｏｆｎｅｕｔｍｌｒｅｄ表１．２中性红染料在荧光分析中的应用Ｔａｂ１－２Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｕ仃ａｌｒｅｄｉｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｌｌｔａｎａｌｙｓｉｓ１．３染料间能量转移及在荧光分析中的应用１．３．１染料间能量转移机理根据能量转移过程中作用机理的不同，能量转移可分为辐射能量转移和非辐射能量转移两种类型。非辐射能量转移又有两种不同的机理，即通过偶极．偶极耦合作用的共振能量转移和通过电子交换作用的交换能量转移【３¨８１。我们主要对非辐射荧光共振能量转移的机理进行概述。荧光猝灭指荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程。猝灭过程可能发生于猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间的相互作用，也可能发生于猝灭剂与荧光物质的基态分子之间的相互作用。前一种过程称为动态猝灭，后一种过程称为静态猝灭。对于动态猝灭作用，温度升高，动态猝灭常数憨矿增大；若是．４．第１章综述静态猝灭，温度升高，产物的稳定性降低，静态猝灭结合常数减小。为证明其猝灭过程，将荧光猝灭过程按动态过程处理，其荧光猝灭方程【３９舯】为凡伊＝』＋墨∥凹＝Ｊ＋岛功砑，其中，而为未加猝灭剂时荧光物质的荧光强度，Ｆ为猝灭剂浓度为朋时荧光物质的荧光强度，妫为猝灭速率常数，功为没有猝灭剂时荧光分子的平均寿命约为：ｌＯ喝Ｓ，墨，是Ｓｔｅｎｌ．、，ｏｌｍｅｒ猝灭常数。以Ｒ伊对，口作Ｓｔｅｍ．Ｖｒｏｌｍｅｒ图，由猝灭曲线斜率求得局，在动态猝灭过程中，一般情况下最大扩散碰撞猝灭速率常数玉，ｇ不大于２．Ｏ×１０ｍＬ／ｍｏｌ－Ｓ，若墨，随温度的升高而减小，且玉，ｇ＞＞２．０×１０旧Ｕｍ０１·Ｓ，则证明以上猝灭不是由于动态碰撞而引起的，而是形成了复合物而引起的静态猝灭。在静态猝灭作用中，静态猝灭荧光强度、猝灭剂浓度与结合常数Ｋ之间的关系为【４１】：口Ｗ＝）～＝巧７＋所７ｒ７，ｑ～，其中Ｋ的单位是Ｌ／ｍｏｌ。以口Ｗ）。。对，凹‘７作图，由曲线截距和斜率可求出染料间的结合常数Ｋ，可推断出染料问的结合能力。根据Ｆ６ｒｓｔｅｒ能量转移【４２，４３１理论，荧光体与猝灭体之间的能量转移效率（目和两者之间的距离（砂的关系【删为Ｅ＝Ｒ０６佃０６＋一，其中局为能量转移效率５０％时对应的距离，ＲＤ６＝＆殆×，矿２澎西矿。厂，式中Ｆ为取向因子，可取受能体和供能体各向随机分布的平均值２／３；Ⅳ为介质的折射指数，一般取水和有机物折射指数的平均值１．３３６，９为给体溯￡缈∥出／删么五，式中用砂为给体在波长五处的荧光强度，￡例为受体在波长的光量子产率，－厂为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱的重叠积分，可表示为：，＝Ａ处的摩尔吸光系数，单位Ｌ／ｍｏｌ·吼；Ｚ是波长，单位啪。而能量转移效率Ｅ又可以由Ｅ＝Ｊ觋测定，其中，和而分别为能量接受体存在和不存在时能量给予体的荧光发射强度。显然，只要得到Ｅ，并通过实测光谱求出积分面积－，，就可算出‰和，．。１．３．２染料间能量转移在荧光分析中的应用染料间能量转移分为碱性染料与碱性染料间、酸性染料与酸性染料间、酸性染料与碱性染料间的能量转移。前两者由于同种染料间的斥力作用，往往需要加入与染料带有相反电荷的表面活性剂，来降低溶液表面张力，拉近染料间的距离，以便发生同种染料间的能量转移。而后者由于酸性、碱性染料带有相反电荷，因为静电引力作用使两者彼此靠近。进而在没有表面活性剂存在时就能够发生能量转移反应。能量转移的应用与单个染料光度测定相比，具有比光度法灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰少，重现性好的特点，该方法已被广泛应用于有机物、无机物等的化学分析、河北大学理学硕十学何论文生物结构研究等领域，其应用见表１．３。表１．３染料间能量转移的应用Ｔａｂｌ一３Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒｂｅ粕，ｅｅｎｄｙｅｓ体系淼４９凇·蒜嚣们等≯僦娄罕嘉嘲，竺三钙妥绿素４５０／５１２４５０俗１２擒黻条件嚣努ｐＨ－７．２３‘Ｂ—Ｒ‘翼器尹鼍尝尹裂誊文献１．Ｏ×ｌ矿粥４．８×１０．７２怒≯ｍｏⅥ。ＢＳＡ：篙霪举銮ｍ，～１０４样中铬。１；蒸４５蝴６罾吖啶橙．罗丹明６Ｇ４５０／５５６ｍｏｌ／Ｌ中Ⅶ他。裂旷５淼筝鬣Ｍ～１０３．６‘。ｐ鼍－７一ＴＨｓ－ＨＣｌｐＨ＝９．２Ｔｒｉｓ．ＨＣｌＢｓ赴３２０．ＨＳＡ：３３０肛３．１×１０４ＨＳＡ：ｏ￣３．０×１０４；言之拿妻雪１０３．２中蛋白ｍ，。１ＰＡＲ．４６５／５０５Ｏ．０６吖啶黄吖啶橙．罗丹明６Ｇ吖啶橙．罗丹明６Ｇ吖啶橙．罗丹明６Ｇ吖啶橙．罗丹明Ｂ吖啶黄．罗丹明６Ｇ４６５／５５６４７０／５５６０～ｌＯ【４９】【５０】【５１】ｐＨ＝７．８６．４２１．３～９８２７．５×１０２～Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ４５０／５５６ＨＣｌ３５０６．０×１０４４５０／５５６ＨＣｌ５．Ｏ×ｌＯ‘３０．０５～Ｏ．７０黧篓军砉崩’１１ｍｏ【５２】４７０／５８０Ｈ２Ｓ０４２．５６１００～２５０【５３】Ｈ２Ｓ０４３．７３５．８５～８７．７４翟；：鐾水中磊１０４石【５４】番凳登笔－吖啶橙ＰＡＮ．４５０／５８０……。ＨＣｌ１．７３２０～１．０×１０４ｐ咖Ｌ１２～６００【５５】罗丹明６Ｇ５４３／５５８ｐＨ＝９．５氨中性３．５５黧蒜≥１０７Ｄ弄年矗【５６】篇季一８霉’ｎｃ．粥Ⅲ３罗嬲ｋ罗丹明６Ｇ５４３，ｓｓｓ５４３，５５８４．ｏｓ４·０５ｍ１３～３６０３∞【５７】翟；头誊中【５７】ｊ≤．５一蒹‘１怒≯一言墨蓄郾，第１章综述１．４染料间荧光能量转移的发展与展望目前能量转移体系的研究主要集中在碱性染料间，至于酸性染料间，酸、碱染料间的能量转移机理以及应用的研究报道甚少，其给体和受体之间的结合机理，给体的猝灭类型，结合模型以及热力学性质等都需进一步深入探讨。基于物质间的竞争作用，利用逆向能量转移进行分析测定的研究未见报道。近年来，随着新的供．受体对的设计合成，新的ＦＲＥＴ体系的开拓，以及将ＦＲＥＴ技术与时间分辨荧光检测、激光共聚焦荧光显微和荧光漂白等光物理技术结合使用将成为未来ＦＲＥＴ技术发展的主要方向。河：Ｉ匕人学理学硕十学何论文第２章酸、碱染料间能量转移机理的研究：荧光素．中性红体系摘要：应用荧光光谱法研究了水溶液体系中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）、四碘荧光素（ＴⅢ）、四氯四碘荧光素（ＴＣＴＩＦ）、四氯四溴荧光素（ＴＣＴＢＦ）分别与碱性染料中性红（ＮＲ）之间的相互作用。实验表明：ＮＲ对各酸性染料的荧光都有较强的猝灭作用，由荧光猝灭结果求得不同温度下ＮＲ与各种酸性染料的结合常数Ｋ。发现Ｋ值随反应温度上升而下降且随酸性染料取代基的电负性增加而增大，进一步证实了该反应为单一静态猝灭过程。由反应焓变、熵变，确定ＮＲ与酸性染料间的结合力主要是静电引力。依据非辐射能量转移机理，探讨了不同温度下各酸性染料与ＮＲ相互结合时，能量转移效率、能量给体与能量受体间距离ｒ等参数，各体系ｒ＜７ｎｍ表明该荧光猝灭是通过非辐射能量转移过程产生的。并发现随着染料取代基的电负性增加，能量转移参数的一些变化规律。关键词：荧光素类酸性染料；中性红；荧光光谱；结合作用２．１引言能量转移荧光分析是现代发光光谱研究中的重要发展方向之一，其中荧光共振能量转移应用最为广泛。所谓荧光共振能量转移是电子激发能在适当的能量给予体（Ｄｏｎｏｒ）能量受体（Ａｃｃ印ｔｏｒ）对之间的传递，传递距离一般为２～５ｎｍ。根据Ｆ６ｓｔ０４２】偶极一偶极共振能量转移理论，当能量给体分子（Ｄ）和受体分子（Ａ）相隔的距离远大于Ｄ·Ａ的碰撞直径时，只要Ｄ与Ａ的基态和第一激发态两者的振动能级差相当，或者说Ｄ的发射光谱与Ａ的吸收光谱能有效重叠，仍然能发生从Ｄ到Ａ的非辐射能量转移。Ｆ６ｓｔｅｒ理论在无机离子‘５３１、有机物【４７＇６３１的测定以及生物分析【４８钟１等方面都有着广泛的应用。但关于染料间转移机理的研究较少【６５＇鲫，应用主要基于表面活性剂存在下碱性染料间的能量转移，对于没有表面活性剂时酸、碱染料间由于静电引力作用发生能量转移的机理和规律的研究未见报道。本文应用Ｆ６ｓｔｅｒ理论，研究了水溶液体系中，四种荧光素酸性染料分别与碱性染料中性红小瓜）之间的相互结合作用，利用ＮＲ对酸性染料荧光的猝灭作用求出了不同温度下各酸性染料与ＮＲ的结合常数、各酸性染料与ＮＲ之间的距离、热第２章酸、碱染料间能量转移机理的研究：荧光素一中性红体系力学常数熵变、焓变等，讨论了各酸性染料取代基、温度对结合常数、各酸性染料与ＮＲ之间的距离的影响，并根据热力学参数确定了该类酸性染料与ＮＲ之间的主要作用力类型。２．２实验部分２．２．１仪器和试剂Ｉ汀．５４０荧光光度计（日本岛津，自行加装了恒温循环水装置）；ＵＶ－２６５紫外可见分光光度计（日本岛津，配有恒温循环水装置）；ｐＨＳ一３Ｃ型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）。四溴荧光素（ＴＢＦ，北京化工厂）、四氯四溴荧光素（ＴＣＴＢＦ，北京化工厂）、中性红（ＮＲ，军事医学科学院）均配成２．０ｘｌＯ‘４ｍ０１／Ｌ的储备液，四碘荧光素（ＴＩＦ，北京化工厂）、四氯四碘荧光素（ＴｃＴＩＦ，上海化学试剂采购站分装）均配１．０×１０４ｍｏｌ／Ｌ的储备液，用时分别稀释至所需浓度。实验用水均为二次蒸馏水。２．２．２实验方法于ｌＯｍＬ比色管中依次加入一定量的某一种酸性染料和ＮＲ溶液，用二次蒸馏水稀释至刻度。混匀后水浴中恒温１０ｍｉｎ，分别测定其相应的吸收光谱和荧光光谱。在狭缝宽度皆为１０ｍ，荧光激发波长为４９０ｎｍ，发射波长分别为５３５ｎｍ（ＴＢＦ．ＮＲ），５１２ｍ（ＴＩＦ—ＮＲ），５３０ｎｍ（ＴＣＴＩＦ．ＮＲ），５５２ｎｍ（ＴＣＴＢＦ－ＮＲ），温度分别为２５℃，３５℃，４５℃时测定各酸性染料—＿ＮＲ的相对荧光强度，。２．３结果与讨论２．３．１酸性染料与ＮＲ的荧光猝灭反应绘制各种荧光素染料与ＮＲ荧光猝灭反应的荧光光谱，以ＴＢＦ与ＮＲ为例见图２．１，发现固定酸性染料的量，不断增加ＮＲ的浓度时，各种酸性染料荧光强度有规律的降低，酸性染料的发射峰的峰位不变，表明ＮＲ对各荧光素染料的荧光都有一定的猝灭作用。谱，以胁ｃ作ｓｔｅｎｌ．、ｂｌｍｅｒ图和以删～一ｃ７作Ｌｉｎｅｗｅａｖ＊Ｂｕｒｋ刚６７１。结果见为进一步阐明其猝灭机理，分别测定２５℃，３５℃，４５℃下各种酸性染料猝灭的荧光光表２．１、２—２，表明：各曲线都具有良好的线性关系（相关系数都ｒ皆大于Ｏ．９９），ＮＲ和各酸性染料反应ｓｔ锄．Ｖｏｌｍｅｒ曲线斜率随反应温度升高均降低，故初步证明此过程为静态猝灭。动态猝灭方程为‘６８】：凡伊＝Ｊ＋蜀吲ｑ＝Ｊ＋Ｋ羽∞、Ｆ分别为无猝灭剂、有猝．Ｏ．河北大导：理’≯硕十学位论文灭剂时的荧光强度）％：猝灭速率常数；功：分子荧光平均寿命约为：１０培Ｓ；Ｋ，：Ｓｔｅｎｌ．Ｖｏｌｍｅｒ猝灭常数；砑：猝灭剂的浓度。按动态猝灭方程处理，由猝灭曲线斜率求得局，见表２．１，各％（１０１２）＞＞２．ｏ×１０１０‰０１·ｓ（最大扩散碰撞猝灭常数），因此进一步证实猝灭不是由于动态碰撞引起的，而是形成了化合物而引起的静态猝灭。在静态猝灭作用中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂之间的关系为【６９】：删。７＝厅７＋鼢ｋ７砑～，由删～～Ｃ２曲线截距和斜率可求出酸性染料与ＮＲ的结合常数Ｋ，见表２．２可知：ＮＲ对各酸性染料的结合常数Ｋ值的变化①、ＴＢＦ＞ＴＩＦ；ＴＣＴＢＦ＞ＴＣＴＩＦ；这是由于溴的电负性比碘大，因此含溴的荧光素染料与中性红形成能量转移对时比含碘的荧光素染料稳定常数大；②、ＴｃＴＢＦ与ＴＢＦ，ＴＣＴＩＦ与ＴＩＦ比较前者结合常数较大，表明染料Ｂ位置电负性取代基的引入对ＴＩＦ结合常数影响较大，对ＴＢＦ影响较小，这可能是氯、碘间电负性相差较大而氯、溴间电负性差较小的缘故。③、且随温度升高Ｋ值下降。即温度升高，ＮＲ－各酸性染料结合稳定性下降。图２．１Ｆｉｇ．２．１ＴＢＦ与ＮＲ猝灭反应的荧光光谱ＱｌｕｅｌｌｃｈｉｎｇｆＩｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｓｐｅｃ姐ｏｆＴＢＦ（ｃＴＢＦ＝２．０×ｌｏ．７ｍｏｎ０谢吐ｌｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＮＲ舶ｍ（１）ｔｏ（１０）．ｃＮＲ（×１０～ｍｏｌ／Ｌ）：Ｏ．Ｏ，Ｏ．１，０．２，Ｏ．３，Ｏ．４，０．５，Ｏ．６，Ｏ．８，１．Ｏ，１．２第２章酸、碱染料问能虽转移机理的研究：荧光素一中性红体系表２·１不同温度下中性红对各酸性染料猝灭的Ｓｔｅｍ—Ｖ．ｏｌｍｅｒ猝灭常数％（ｍｎｏｌ。Ｓ）Ｔ｛ｌｂ２－ｌＴｈｅＳｔｅｍ－Ｖ．ｏｌｍｅｒｑｕｅｎｃｈｃｏｎｓｔａｎｔｓｆｏｒｄｉｆｆ；潮ｔＮＲ谢ｔｈｅＶｅ哆ａｃｉｄｉｔｙｄｙｅｓｔｕ行ａｔｄｉ行．ｅｒｅＩｌｔｔ咖ｐｅｒａｔｕｒｅｓ表２．２不同温度下中性红对各酸性染料猝灭的结合常数Ｋ（Ｌ／ｍ０１）Ｔ｛ｌｂ２．２Ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔｓｆ．ｏｒｄｉｆｆ．ｅｒｅｎｔＮＲｗｉｔｌｌｅｖｅ：ｒｙａｃｉｄｉ够ｄｙｅｓｔＩｌ行ａｔｄｉ仃．ｅｒｅｎｔｔｅＩｌｌｐｅｒａｔｕｒｅｓ河北大学理学硕十学何论文２．３．２酸性染料与中性红主要结合力的确定分子间的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等。当温度变化不大时，反应焓变４日可以看作是一个常数，由加俾ｊ膨∥＝彳即／乃．Ｊ／黝／Ｒ；４Ｇ＝４厚财Ｓ，彳Ｇ＝坝刀枨可以求出焓变４日、熵变彳Ｓ。彳日＜Ｄ，彳Ｓ＜Ｄ分子间作用力主要为色散力，彳日＜Ｄ，彳ｐＤ分子间作用力主要为静电引力【７０１。由表２．３可以看出：么日＜Ｄ，彳◇Ｄ，说明该能量转移反应为放热反应，且反应使体系熵变增加，彳Ｇ＜Ｏ表明酸、碱染料问的能量转移反应能自发进行，且酸性染料中所含电负性取代基的电负性越强、电负性取代基越多能量转移反应越容易进行。由于所研究形成能量转移的染料带有相反电荷，容易以静电引力发生作用即荧光素染料与中性红间主要作用力是静电引力。表２．３酸性染料与中性红结合过程的热力学参数Ｔ芒ｌｂ２－３Ｔｈｅｔｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｃｏｎｓｔａｎｔｓｆ．０ｒｅＶｅ巧ａｃｉｄｉ够ｄｙｅｓｔＩｌｆｒａｎｄＮｅｕ仃ａｌｒｅｄ２．３．３特定结合部位微环境研究测出中性红的紫外一可见吸收光谱，发现其与各种酸性染料的荧光光谱都有部分重叠（图２．２阴影部分）。按照Ｆ６ｒｓｔｅｒ能量转移机理，能量给体与能量受体间距离，．与能量转移效率为５０％时所对应的临界能量转移距离ＲＤ及能量转移效率Ｅ之间有如下关系【３９１：Ｅ＝尺Ｄ伽０６＋力，其中：Ｒ０６＝８．殆×Ｊ旷澎剑、，ｏ；Ｐ是和能量给体及受体跃迁矩相互有关的因子取２／３；Ⅳ是溶剂的折射率，取水和有机物的平均值１．３３６；多为当无受体存在时能量给体的荧光量子产率：查文献【７１—７３１知磷光量子产率为第２章酸、碱染料问能帚转移机理的研究：荧光素一中性红体系ＴＢＦ＜ＴＩＦ＜ＴＣＴＢＦ＜ＴＣＴＩＦ，而荧光量子产率正好相反；ＴＢＦ、ＴＩＦ分别取Ｏ．１９、Ｏ．０２，ＴｃＴＢＦ、ＴｃＴＩＦ近似取ｏ．０２：／为光谱的重叠积分，且有：，＝删ｓ例∥厶五／劂厶Ａ，通过自行设计计算机程序处理数据得出，值，刑为给体在波长Ａ处的荧光强度，￡Ⅲ为受体在波长Ａ处的摩尔吸光系数，单位Ｌ／ｍｏｌ·ｃｍ；Ａ是波长，单位锄。由临界转移距离尺Ｄ（在计算勘时可认为能量给体与受体间相互取向是无规则的，此时因子髟－２／３）和实验测得能量转移效率Ｅ＝Ｊ娲就可以计算出能量给体与受体间的距离，．。见表２．４，可知：各体系，．＜７ｎｍ且随温度升高，，值略有增大，即温度升高分子间距离增加不利于能量转移反应进行；能量转移效率也有所降低；硒值变化不大；不同染料与中性红结合的ｒ值变化规律与结合常数变化规律基本一致。图２－２ＮＲ的吸收光谱、ＴＢＦ的荧光光谱（２５℃）Ｆｉｇ．２－２Ａｂｓｍａｎｃｅｓｐｅｃ仃ａｏｆＮＲ锄ｄｎｕｏｒｅｓｃ∞ｃｅｓｐｅｃ舰ｏｆＴＢＦ（２５℃）１．吸收光谱；２．荧光光谱ｃ（ＴＢＦ）＝ｃ（ＮＲ）＝１．０×１０。５ｍｏ儿河北大学理学硕十学位论文表２－４不同温度下各酸性染料与中性红问Ｅ％及，．、岛、，值１＇ａｂ２４Ｅｎｅ唱ｙ昀ｎｓｆ；ｅｒｅｆｆｉｃｉｅｌｌｃｙＥ％，，．，勘锄ｄ．，ｖａｌｕｅｓｂｅＭｅｅＩｌｅＶｅ巧ａｃｉｄ时ＤｙｅｓｔＩｌｆｒａｎｄＮＲａｔｄｉ伍ｅｒｅｎｔｔ锄ｐｅｒａｔｕｒｅｓ２．４结论研究结果表明：由于酸、碱染料间的静电引力作用，酸、碱染料问的非辐射能量转移反应不须借助表面活性剂降低溶液表面张力就可以进行；参与反应染料的取代基电负性越大，静电吸引作用越强，能量转移反应越容易进行，且能量转移体系的结合常数变大，稳定性增加，能量给体与能量受体间距离，变小；体系随温度增加稳定性、，值等减小；酸、碱染料间的猝灭反应为静态猝灭反应。第３章四演荧光素一中性红荧光能蛩转移抑制法测定肝素第３章四溴荧光素一中性红荧光能量转移抑制法测定肝素摘要：在ｐＨ６．６５的Ｂｎｔｔｏｎ．ＲｏｂｉＩｌｓｏｎ（Ｂ—Ｒ）缓冲溶液中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）与碱性染料中性红（ＮＲ）之间由于静电吸引而能够发生有效的能量转移，使得能量受体ＮＲ荧光增强，同时能量给体ＴＢＦ的荧光猝灭。而肝素的加入对该荧光体系间的能量转移产生了明显的抑制作用，随肝素量的增加ＴＢＦ荧光依次增强，即能量转移过程受到抑制而发生逆转，由此建立了一种测定微量肝素的新方法。结果表明，肝素在０．１～２．０ｍ∥Ｌ范围内与ＴＢＦ的荧光增强程度呈良好的线性关系，方法检出限Ｏ．０７１ｍ∥Ｌ。该方法用于肝素钠注射液中肝素钠效价的测定，六次平行测定相对标准偏１．３９％～３．５９％，回收率９５．２％～１０５．３％，结果满意。关键词：四溴荧光素；中性红；荧光能量转移；抑制；肝素３．１引言肝素（Ｈｅｐ撕ｎ，简称为Ｈｅｐ）为葡糖胺聚糖，是由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸组成的多糖链混合物，在水溶液中由于其酸性基团的离解而成为带多个负电荷的大阴离子，是蛋白多糖的一种，在人体内由肥大细胞分泌而自然存在于血液中，具有广泛的生物学功能，临床上用其钠盐，作为预防血栓形成和治疗急性静脉血栓的重要药物【７４】。肝素的检测法有多种，分属于生物方法和化学方法，生物方法是法定方法，但受生物个体的影响较大，不易掌握。化学方法中分光光度法【７５】、ＨＰＬＣ法【７６１、毛细管电泳法ｆ７７１、电化学分析法【７８】、光散射法【７９１已应用于肝素的测定。光度法由于操作简便、快速、仪器价廉、灵敏度高的优点而得到广泛的应用。荧光能量转移分析法具有比光度法灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰小，重现性好的特点【４８１。但用于肝素的测定未见报道，本文用ＴＢＦ．ＮＲ荧光能量转移体系与肝素作用，建立了能量转移荧光测定微量肝素的新方法，该法操作简便、快速，灵敏度较高，可直接用于肝素钠注射液效价的测定。３．２实验部分３．２．１仪器与试剂ＲＦ一５４０荧光光度计（日本岛津）；ＵＶ－２６５紫外可见分光光度计（日本岛津）；ｐＨＳ一３Ｃ一１５．河北人学理学硕十学位论文型酸度计（上海雷磁分析仪器厂）。肝素钠（１４０ＩＬＪ／ｍｇ，北京奥博星生物技术有限责任公司）标准溶液：准确配置１．Ｏ∥Ｌ（１４０ＩＵ／ｍＬ）肝素钠水溶液作为实验贮备液，于４℃冰箱保存，用时适当稀释。四溴荧光素、中性红浓度皆为２．０×１０４ｍｏ儿水溶液；０．２ｍ０１／Ｌ的Ｂ．Ｒ系列缓冲溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子蒸馏水。３．２．２实验方法于１０ｍＬ比色管中依次加入２．Ｏ×ｌＯ。６ｍ０１／ＬＴＢＦｐＨ２．０ｍＬ，２．０×１０４ｍｏｌ／ＬＮＲＯ．５ｍＬ，６．６５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液０．５ｍＬ及一定量肝素钠标准溶液或肝素钠注射液样品溶液，以水定容至刻度，摇匀、静置３０ｍｉｎ，在激发波长４９０ｎｍ，发射波长５３５ｎｍ处测定溶液荧光强度或扫描荧光光谱，同时作试剂空白。３．３结果与讨论３．３．１ＴＢＦ．ＮＲ间的能量转移染料间能量转移的首要条件是给体的发射光谱和受体的吸收光谱要有相当程度的重叠。强荧光碱性染料ＴＢＦ荧光发射波长为５３５１１ＩＩｌ，酸性染料ＮＲ的最大吸收波长为５３０姗，两者波长相近，ＴＢＦ的荧光发射光谱与ＮＲ的吸收光谱有较大的重叠。这样就为ＴＢＦ与ＮＲ的能量转移提供了前提条件，同时两染料带有相反电荷，使得两者分子间由于静电吸引作用而彼此靠近，更利于发生染料间发生能量转移。本试验用波长４９０啪的光去激发ＴＢＦ和ＮＲ的混合体系，这样可以保证ＴＢＦ有较大的发射，而ＮＲ又不会被激发，使能量转移效果达到最好。固定ＴＢＦ用量，改变ＮＲ用量，ＴＢＦ、ＮＲ间的能量转移，见图３．１。表明，在混合体系中，给体ＴＢＦ在５３５ｎｍ处的荧光峰比转移前明显下降，而受体ＮＲ在６００ｍ处荧光峰比转移前有所增强，且随着ＮＲ的用量的增加，ＴＢＦ的荧光峰依次下降，ＮＲ的荧光峰逐渐上升，这充分说明两种染料间发生了能量转移过程。第３章四溴荧光素一中性红荧光能毋转移抑制法测定肝素＾／舢图３．１ＴＢＦ－ＮＲ能量转移荧光光谱图Ｆｉｇ．３－ｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｎ．ａｏｆｅ１１ｅｒｇｙ锻ｍｓ断ｏｆＴＢＦ小限ｓｙｓｔｅｍ１．ＣＮＲ－２×ｌＯ．６ｍｏｎ。；Ｆｒｏｍ（２）ｔｏ（７）．ＣＴＢｆ＝２×１０～ｍｏｌ／Ｌ，ＣＮＲ＿（Ｏ，Ｏ．２，Ｏ．４，Ｏ．８，１．２，２．４）×ｌＯ。５ｍｏ儿３．３．２肝素对ＴＢＦ．ＮＲ能量转移体系的影响１６０．８０．入／姗图３．２肝素质量浓度对ＴＢＦ小取荧光光谱的影响Ｆｉｇ．３—２Ｅ虢ｃｔｏｆＨｅｐ撕ｎｃｏｎｃｅｎ仃ａｔｉｏｎｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒａｏｆＴＢＦ．ＮＲｓｙＳｔｅｍ１．ＴＢＦ２．ＮＲ３．ＴＢＦｊＮＲ４～６．ＴＢＦ—ＮＲ—Ｈ印ＣＴＢＦ＝４．０×１０．７ｍｏｌ／Ｌ，ＣＮＲ＝１．０×１０’５ｍｏｌ／Ｌ，丘啪（４）ｔ０（６）．ＣＩ旷０．４，０．８，１．６ｍ班按实验方法，测定ＴＢＦ．ＮＲ体系中加入不同浓度肝素钠标准溶液的荧光光谱，结果见图３．２发现，随着肝素量的增加ＴＢＦ．ＮＲ体系中给体ＴＢＦ在５３５ＩｌＩＩｌ处的荧光峰依次上升，且其峰上升幅度与肝素浓度成线性关系。表明肝素的加入使ＴＢＦ．ＮＲ体系的能量一１７．河北大学理学硕十学位论文转移过程受到抑制，产生了逆向的能量转移，从而造成给体荧光强度的增加。利用ＴＢＦ荧光峰的增加程度与肝素浓度的线性关系，可以建立测定肝素的新的分析方法。３．３．３酸度的影响按实验方法操作，在ｐＨ４．５８—８．４５的范围内试验了ｐＨ值对体系的影响，结果见图３．３。由图中可以看出，当ｐＨ为６．４６～７．６５时△Ｆ变化最大且稳定，超出此范围荧光强度急剧降低，试验选择ｐＨ６．６５为最佳酸度。改变缓冲溶液种类，结果表明：分别使用Ｂ．Ｒ，Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，ＫＨ２Ｐ０４．ＮａＯＨ，ＫＨ２Ｐ０４．Ｎａ２ＨＰ０４，Ｎａ２ＨＰ０４．柠檬酸缓冲溶液控制体系酸度时，体系荧光强度依次降低，因此本试验选用ｐＨ６．６５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液。考察其用量的影响表明：在Ｏ．３～１．０ｍＬ时体系荧光强度最大且稳定，本试验选择ｐＨ的Ｂ．Ｒ缓冲溶液的最佳用量为０．５ｍＬ。６．６５图３－３Ｆｉｇ．３·３ｐＨ值对体系的影响Ｅｆｒｅｃｔｏｆｔｌｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｃｉｄｉ够ｏｎｔｌｌｅｓｙＳｔ锄３．３．４四溴荧光素、中性红的用量选择分别改变ＴＢＦ、ＮＲ的用量，按实验方法操作，结果表明：当ＴＢＦ用量为２．４ｘ１０’一～６×１０‘７ｍ０１／Ｌ及ＮＲ的用量为Ｏ．８×１０～～２．０×１０。５ｍｏ儿时，体系荧光强度增加最大。本ｍＬ’实验选２．Ｏ×１０击ｍ０１／Ｌ的ＴＢＦ溶液最佳用量２．ＯｍＬ，２．Ｏ×１０４ｍｏｌ／ＬＮＲ最佳用量Ｏ．５此时能量转移效率１１＝８６．８％达到最大，ＴＢＦ与ＮＲ的摩尔比为ｌ：２５。３．３．５反应时间、体系稳定性及加样顺序的影响试验结果发现室温下体系反应２０ｍｉｎ即达到平衡，荧光强度值达到最大，在５ｈ内第３章四溴荧光素一中性红荧光能母转移抑制法测定肝索基本保持恒定。改变加样顺序进行实验，结果表明，当加样顺序依次为ＴＢＦ、ＮＲ、Ｂ．Ｒ缓冲溶液、Ｈ印时，反应稳定且荧光强度最大。这也间接表明肝素的加入使能量转移过程受到破坏，从而造成ＴＢＦ荧光增强。３．３．６共存物质的影响肝素浓度为１．０ｍ∥Ｌ时，常见的金属离子、氨基酸、葡萄糖等物质对体系的干扰试验结果见表３．１，由表３．１中可知，常见的干扰物质对测定的影响不大，表明本方法具有很好的选择性。实验了十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），十六烷基三甲胺（ＣＴＭＡＢ）等表面活性剂对反应的影响，结果表明它们的加入会干扰体系的测定，说明离子型表面活性剂参与了体系的竞争反应。表３．１１＇ａｂ３－１干扰物质对肝素测定的影响Ｅ丘．ｅｃｔｏｆｃｏｅｘｉｓ锄毗ｓｕｂｓｔａｎｃ懿０ｎｔｈｅｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈ印撕ｎ３．３．７工作曲线、线性范围及检出限按实验方法操作绘制测定肝素钠的工作曲线，结果表明肝素钠浓度在Ｏ．１～２．Ｏｍ∥Ｌ范围内与彳Ｆ呈线性关系，线性回归方程为彳，＝．１．４３１＋２７．１０３５ｃ（ｍ∥Ｌ），相关系数，－＝０．９９７２，平行测定１１次空白，以３６依计算得该方法检出限为Ｏ．０７１ｍ∥Ｌ。３．３．８样品分析分别取不同厂家的肝素钠注射液（标示量６２５０ＩＵ／ｍＬ）２．ＯｍＬ于２００ｍＬ容量瓶中，用水定容并摇匀。再取该溶液２．ＯｍＬ稀释于２００ｍＬ容量瓶中。取此稀释液２．ＯｍＬ，河北大学理学硕十学位论文按实验方法对肝素钠的效价进行了测定，并进行回收实验，结果见表３．２。表明该方法用于注射液中肝素钠的测定，结果满意。表３－２肝素钠注射液效价的测定结果（ｎ＝６）１＇ａｂ３—２ＤｅｔｅｎＩｌｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏ仆印ａｒｉｎｓｏｄｉｕｍｉｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（ｎ－６，ＩＬＪ／ｍＬ）３．４结论本文利用ＴＢＦ．ＮＲ荧光能量转移体系与肝素作用，建立了能量转移荧光测定微量肝素的新方法，该方法具有操作简便、快速，灵敏度较高的特点，可直接用于肝素钠注射液肝素钠效价的测定。第４章四溴荧光素一中性红逆向能量转移荧光法测定蛋白质第４章四溴荧光素一中性红逆向能量转移荧光法测定蛋白质摘要：在ｐＨ２．３５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液中，酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）与碱性染料中性红（ＮＲ）之间由于静电吸引能够发生有效的能量转移，使能量受体ＮＲ荧光增强，能量给体ＴＢＦ的荧光猝灭。在该体系中加入人血清白蛋白（ＨＳＡ），由于竞争作用使得ＨＳＡ的加入破坏了ＴＢＦ．ＮＲ间的能量转移，产生了明显的逆向反应，并且生成ＨＳＡ．ＴＢＦ络合物，利用该络合物的荧光增加强度与ＨＳＡ含量间的线性关系建立了一种测定微量血清蛋白的新方法。结果表明，血清蛋白工作曲线线性范围０．６～１２．Ｏｍ∥Ｌ；方法检出限０．２５ｍ∥Ｌ；六次平行测定相对标准偏差１．９４％～４．５８％；回收率９６．３％～１０４．９％。该方法的稳定性好，选择性高，直接用于人血清试样中总蛋白含量的测定，与常用的双缩脲法基本一致。关键词：四溴荧光素；中性红；荧光能量转移；蛋白４．１引言蛋白质是构成一切生物的生命物质之一，它的定量测定在医学、药学、生命科学和食品营养学中有着重要意义。蛋白质的测定方法有光度法【８０￣８２１、荧光法【８３１、散射光谱法【眦８６１等。其中光度法在蛋白质的分析测定中得到了广泛的应用，它们是基于蛋白质与染料或与染料．金属络合物的结合反应而建立的，这些方法在反应时间、灵敏度、选择性、重现性以及稳定性方面各有优缺点。荧光能量转移分析法具有比光度法灵敏度高，与常规荧光法和共振光散射相比受瑞利散射光干扰小，重现性好的特点【４８１。本文在ＴＢＦ＿ＮＲ荧光能量转移体系中加入人血清白蛋白，由于血清白蛋白、ＴＢＦ对ＮＲ的竞争作用，使能量转移过程发生逆转产生蛋白．ＴＢＦ络合物的荧光，据此建立了逆向能量转移荧光测定微量蛋白的新方法。与直接利用ＨｓＡ．ＴＢＦ络合物荧光测定蛋白方法相比检测线性范围宽、检出限值低、准确度高，直接用于人体血清样品蛋白含量的测定，结果满意。４．２实验部分４．２．１仪器与试剂ＲＦ－５４０荧光光度计（日本岛津）；ＵＶ－２６５紫外可见分光光度计（日本岛津）；ｐＨｓ一３Ｃ型．２１．洞北大号：理孑：硕十辱：何论文酸度计（上海雷磁分析仪器厂）。人血清白蛋白（ＨＳＡ）（卫生部上海生物制品研究所）配成１．Ｏ∥Ｌ水溶液，置于１～４℃冰箱中，用时适当稀释。四溴荧光素（ＴＢＦ）、中性红（ＮＲ）浓度分别为２．０×ｌ旷、２．０×１０‘４ｍ０１／Ｌ水溶液；ｐＨ＝２．３５Ｂ．Ｒ缓冲溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子蒸馏水。４．２．２实验方法于ｌＯｍＬ比色管中依次加入２．Ｏ×１０击ｍｏｌ／ＬＴＢＦｐＨ１．８ｍＬ，２．０×１０。４ｍｏｌ／ＬＮＲＯ．５ｍＬ，２．３５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液１．ＯｍＬ及一定量ＨＳＡ标准溶液或人体血清样品溶液，以水定容至刻度，摇匀、静置２０ｍｉｎ，在激发波长４９０强度或扫描荧光光谱，同时作试剂空白。ｍ，发射波长５４７ｎｍ处测定溶液荧光４．３结果与讨论４．３．１ＴＢＦ．ＮＲ间的能量转移染料问能量转移的首要条件是给体的发射光谱和受体的吸收光谱要有相当程度的重叠。强荧光酸性染料ＴＢＦ激发、发射波长为５１７／５３５姗，碱性染料ＮＲ激发、发射波长为５４５／６００ｍ，最大吸收波长为５３０Ｉｌｌｌｌ，ＴＢＦ的发射波长５３５ｎｍ与ＮＲ的吸收波长为５３０ＩｌＩｌｌ两者仅相差５ｎｍ。这样就为ＴＢＦ与ＮＲ的能量转移提供了前提条件，同时两染料带有相反电荷，使得两者由于静电吸引作用而彼此靠近，更有利于染料间发生能量转移反应。本试验用波长４９０ｎｍ的光去激发ＴＢＦ和ＮＲ的混合体系，这样可以保证ＴＢＦ有较大的发射，而ＮＲ又不会被激发，使能量转移效果达到最好。ＴＢＦ、ＮＲ间的能量转移见图４．１，可知在混合体系中随着ＮＲ用量增加，给体ＴＢＦ在５３５１１ＩＩｌ处的荧光峰明显依次下降，而受体ＮＲ在６００ｎｍ处荧光峰依次增强，这表明两种染料间发生了能量转移反应。第４章四溴荧光素一中性红逆向能鼍转移荧光法测定蛋门质入／ｎ＿图４．１Ｆｉｇ．４－１ＴＢＦ．ＮＲ能量转移荧光光谱图ＦｌｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｓｌ，ｅｃ仃ａｏｆｅＩｌｅ哟，觚ｎｓｆｅｒｏｆＴＢＦ－ＮＲｓｙｓｔｅｍＣＴＢＦ＝２．０×１０～ｍ０１／Ｉ。，舶ｍ（１）ｔ０（８）．ＣＮＲ＝（Ｏ，０．２，０．４，０．６，０．８，１．Ｏ１．２，１．６）×ｌＯ‘５ｍｏｌ／Ｌ４．３．２蛋白质对ＴＢＦ—ＮＲ能量转移体系的影响４０．Ｘ‘ｎｍ图４－２荧光发射光谱Ｆｉｇ．４－２１．ＴＢＦ２．ＴＢＦ．ＨＳＡ３．ＮＲＦｌｕｏｒｅＳｃｃＩｌｃｅｓｐｅｃ慨６～８．ＴＢＦ二ＮＲ—ＨＳＡ４．ＮＲ．ＨＳＡ５．ＴＢＦ二ＮＲＣＴＢＦ＝３．６×１０－７ｍｏ儿，ＣＮＲ＝１．０×ｌＯ一５ｍｏ儿，Ｃ｝ＩｓＡ：４．０ｍｇ／Ｌ；‰（６）ｔ０（８）．ＣＩＩｓＡ＝２．Ｏ，４．０，６．Ｏｍｇ／ＬＨｓＡ对ＴＢＦ－ＮＲ体系的影响见图４．２，ＴＢＦ的荧光峰为５３５ｎｍ，ＴＢＦ．ＨｓＡ的荧光．２３－河北人学理学硕十学位论文峰位于５４７ｎｍ，且在５４７ｎｍ处的荧光峰增强。表明ＴＢＦ与ＨＳＡ在实验条件下反应生成络合物，这是由于蛋白质在酸性介质中（等电点４．７前）由于其肽链上的氨基酸残基带正电荷，而以带多余正电荷的生物大分子状态存在，’此时它可借助于静电引力与带负电荷的酸性染料ＴＢＦ形成超分子化合物，并引起光谱特性的变化。随着ＨＳＡ的加入ＴＢＦ．ＮＲ体系中给体ＴＢＦ的荧光峰（曲线５）由５３５啪红移至（曲线６）５４７ｎｍ，此时蛋白质与ＮＲ都带正电荷，二者不发生反应（曲线４），由于ＨＳＡ、ＮＲ对ＴＢＦ的竞争作用，使得ＴＢＦ．ＮＲ能量转移体系被逆转，即由于ＴＢＦ．ＨＳＡ缔合物的形成，破坏了ＴＢＦ．ＮＲ间的能量转移，释放出的ＴＢＦ与ＨＳＡ结合使ＴＢＦ．ＨＳＡ５４７ｎｍ的荧光增强，利用５４７姗荧光峰的增加程度与血清白蛋白含量的线性关系，可以建立测定蛋白的新的分析方法。４．３．３酸度的影响溶液ｐＨ值对体系的影响见图４．３，表明ｐＨ为１．８２～２．５８时△Ｆ最大且稳定，此时蛋白质分子带有正电荷易与带负电荷分子由于静电引力结合，超出此范围荧光强度急剧降低。分别试验Ｂ．Ｒ，柠檬酸钠．Ｈｃｌ，邻苯二甲酸氢钾．ＨＣｌ三种缓冲溶液对体系的影响，结果表明体系荧光强度依次降低，因此本试验选用ｐＨ２．３５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液。其用量试验表明：在Ｏ．５～１．５ｍＬ时体系荧光强度最大且稳定，本试验选择ｐＨ２．３５的Ｂ．Ｒ缓冲溶液的最佳用量为１．ＯｍＬ。图禾３缓冲溶液ｐＨ值对体系的影响Ｆｉｇ．４·３１’ｌｌｅＥ氐ｃｔｏｆｂｕ脓ｓｏｌｌｌｔｉｏｎａｃｉｄｉ哆ｏｎｍｅｓ姆锄４．３．４四溴荧光素、中性红的用量及能量转移效率第４章四浪荧光素一中性红逆向能‘蛩转移荧光法测定蛋白质能量转移效率叩可以由给体荧光的猝灭或受体荧光的增强，由公式【６２１叩＝Ｊ一丹Ｒ得出（其中Ｆ为受体存在时给体的荧光强度，Ｒ为无受体存在时给体的荧光强度）。固定ＴＢＦ用量改变ＮＲ用量，能量转移效率叩随ＮＲ与ＴＢＦ摩尔比的变化见图４－４，表明当ＴＢＦ与ＮＲ摩尔比小于５０时，瑁值随ＴＢＦ与ＮＲ摩尔比增大而急剧增加，ＴＢＦ与ＮＲ摩尔比大于等于５０时，卵达到最大且变化缓慢。ＮＲ＿ＥＹ摩尔比图“能量转移效率图Ｆｉｇ．４＿４１＇ｌｌｅｅｍｃｉｅｎｃｙｏｆ朗ｅｒｇｙｔｍｎｓｆ打按实验方法操作固定ＨＳＡ用量，分别改变ＴＢＦ、ＮＲ的用量，结果表明：当ＴＢＦ用量为２．４ｘ１０～～４．Ｏ×１０‘７ｍｏｌ／Ｌ及ＮＲ的用量为０．４×１０一～１．２×１０‘５ｍｏｌ／Ｌ时，体系荧光强度最大。本试验选２．Ｏ×１０击ｍｏ儿的ＴＢＦ溶液最佳用量１．８ｍＬ，２．Ｏ×１０４ｍｏｌ／ＬＮＲ最佳用量０．５ｍＬ。此时体系彳＝７６．４％，ＮＲ与ＴＢＦ的摩尔比为２７．８：１。对比图４．４发现测定最佳用量正处在图４．４中呷随摩尔比变化的敏感区域，此时在能量转移体系中随着蛋白含量的增加，蛋白与ＴＢＦ反应使转移体系中的ＴＢＦ量减少，使参与能量转移的ＮＲ与ＴＢＦ的摩尔比增加，造成叩值增大，图４．２皓线６、７、８在６００１１ＩＩｌ处峰高增加也可以证明叩值增大。玎越大转移体系ＴＢＦ处的荧光强度就越低，即利用能量转移测定可使体系空白值减小。４．３．５反应时间及加样顺序的影响试验表明室温下体系反应１５ｍｉｎ即达到平衡，荧光强度值达到最大，在５ｈ内基本保持恒定。改变加样顺序结果表明，当加样顺序依次为ＴＢＦ、ＮＲ、Ｂ．Ｒ缓冲溶液、ＨＡｓ河北大学理学硕｝学何论文时，反应稳定且荧光强度最大。这也间接表明蛋白质的加入使能量转移过程受到破坏。本试验选择静置时间２０ｍｉｎ，加样顺序依次为ＴＢＦ、ＮＲ、Ｂ．Ｒ缓冲溶液、ＨＳＡ。４．３．６共存物质的影响ＨＳＡ浓度为２．Ｏｍ叽，在士５％的误差范围内允许存在的外来干扰物质的量为（ｍ∥Ｌ）：Ｎａ＋（３００）、Ｋ＋（２６０）、Ｂａ２＋（２００）、Ｚｎ２＋（１００）；乒天冬氨酸、乒天冬酰胺、｝脯氨酸、卜苯丙氨酸、｝缬氨酸、｝甘氨酸（３０）；仁赖氨酸、厶甍氨酸、｝异亮氨酸、卜精氨酸、｝半胱氨酸（２０）；卜丙氨酸、｝丝氨酸、卜甲硫氨酸、｝组氨酸，仁酪氨酸、ｌ苏氨酸、｝谷氨酰胺、三．谷氨酸（６）和柠檬酸（８２）及大量的常见阴离子等，由于实际样品测定时需将样品稀释千倍以上，因此实际样品测定时可以不考虑这些共存物的干扰，方法具有较好的选择性。４．３．７工作曲线及检出限按实验方法操作考察测定ＨＳＡ的工作曲线、线性范围及平行测定１１次空白，以３腿计算方法检出限，能量转移法：么Ｆ＝－Ｏ．８７ｌＯ＋４．４６３４Ｃ（ｍ∥Ｌ），，．＝Ｏ．９９９２，线性范围Ｏ．６一１２．Ｏｍ∥Ｌ，检出限０．２５ｍ∥Ｌ；ＴＢＦ．ＨｓＡ荧光直接测定法：彳Ｆ＝一９．９１１６＋５．４００８Ｃ（ｍｇ／Ｌ），，．＝Ｏ．９９７６，线性范围２．４～６．８ｍ∥Ｌ，检出限Ｏ．３１ｍ∥Ｌ。由此可知能量转移测定使方法线性范围变宽，检出限值减小。４．３．８样品分析利用上述方法，对病人血清（由保定市第一中心医院提供）中的蛋白质含量进行测定。测定前，首先吸取新鲜的人血清样品Ｏ．２ｍＬ用水稀释ｌＯｏｏ倍，再从稀释液中取１．２ｍＬ，按实验方法平行六次进行测定同时进行方法回收率的测定，结果列于表４—１，可知本方法与医院常用的双缩脲法【８７】测定结果基本一致，结果满意。第４章四溴荧光素一中性红逆向能餐转移荧光法测定蛋自质表４．１人血清样品中蛋白含量的测定结果（ｎ：６）１’ａｂ４－１Ｄｅｔ咖ｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒｈｌｍ锄ｓｅｎｌｍｓａｍｐｌｅｓ（ｎ＝６）４．４结论本文在ＴＢＦ．ＮＲ荧光能量转移体系中加入血清白蛋白，由于血清白蛋白、ＴＢＦ对ＮＲ的竞争作用，使能量转移过程发生逆转产生蛋白．ＴＢＦ络合物的荧光，由此建立了逆向能量转移荧光测定微量蛋白的新方法。与直接利用ＨＳＡ．ＴＢＦ络合物荧光测定蛋白方法相比具有检测线性范围宽、检出限值低、准确度高的优点，直接用于人体血清样品蛋白含量的测定，结果令人满意。河北大学理学硕十学位论文第５章胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究摘要：研究了阳离子表面活性剂（ＣＳＡＡ）溴代十六烷基三甲铵（ｃｎ压ＡＢ）及溴代十六烷基吡啶（ＣＰＢ）在水溶液中与阴离子酸性染料四溴荧光素（ＴＢＦ）的荧光反应，发现当ＣＳＡＡ单体与ＴＢＦ形成离子缔合物时，ＴＢＦ的荧光发生猝灭，而随着ＣｓＡＡ胶柬与ＴＢＦ继续作用又会产生一个新的、更强的荧光。进而研究了阳离子表面活性剂溴代十六烷基三甲铵及溴代十六烷基吡啶胶束体系中酸性阴离子荧光染料荧光素与四溴荧光素间的能量转移条件。结果表明只有在带相反电荷的阳离子表面活性剂形成的胶束环境中，阴离子染料间的能量转移才可能发生，且在２／３临界胶束浓度（ＣＭｃ）时能量转移效率达到最大。并推测了胶束体系中染料间能量转移模型及染料间能量转移的一般规律。关键词：阴离子表面活性剂；荧光素；四溴荧光素；能量转移；模型５．１引言荧光素、四溴荧光素等用于荧光光度测定报道已经很多【８８１，这些染料都具有很强的荧光，但其最佳激发、发射波长差较小，因此在实际应用时为了避免瑞利散射光的干扰一般不选取染料的最佳激发波长，这样就造成染料荧光降低，方法灵敏度降低。应用能量转移技术可以很好地解决这一问题，在能量转移体系中受体的荧光是借吸收给体荧光产生的，这样既可保证受体最大限度发出荧光，也可避免光源散射光的影响。因此能量转移荧光分析具有灵敏度高、重现性好的优点。在阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠中碱性染料间能量转移的研究及应用已有报道【５３＇６５１，但对能量转移效率与临界胶束浓度（ＣＭＣ）间的关系及转移模型等的研究未见报道。本文对荧光素与ＴＢＦ在各种表面活性剂中的能量转移行为研究发现，只有在与能量转移的染料带有相反电荷的胶束中才发生能量转移现象，并推测了胶束中能量转移模型。５．２实验部分５．２．１仪器与试剂ＵＶ－２６５紫外可见分光光度计（日本岛津）；ｌ心．５４０荧光分光光度计（日本岛津）。．２Ｒ．第５章胶求体系中荧光素０四溴荧光素问能量转移条ｒ｝：及模础研究ｐＨＳ．３Ｃ型酸度计（上海雷磁仪器厂）。四溴荧光素（ＴＢＦ）：５．Ｏ×１０４ｍｏｌ／Ｌ水溶液，用时稀至５．Ｏ×１０‘５ｍｏｌ／Ｌ；荧光素：５．Ｏ×１０。６ｍｏ儿水溶液；溴代十六烷基三甲铵（ＣＴＭＡＢ）、溴代十六烷基吡啶（ｃＰＢ）、十二烷基苯磺酸钠（ＤＢＳ）均配成５．Ｏ×ｌＯ。ｍｏｌ／Ｌ水溶液；十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）：１．Ｏ×１０。２ｍｏｌ／Ｌ水溶液；嘶ｔｏｎＸ一１００：２．Ｏ×１０。ｍｏｌ／Ｌ水溶液；所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。５．２．２实验方法在ｌＯｍＬ比色管中依次加入荧光素５×１０击ｍｏｌ／ＬＣＴＭＡＢ或ＣＰＢ５×ｌＯ。３ｍｏｌ／Ｌ２．０１．０ｍＬ，ＴＢＦ５×１０’５ｍ０１／Ｌ０．５ｍＬ，ｍＬ，用水稀释至刻度摇匀。放置３０ｍｉＩｌ，在Ａ既ｎ锄＿４７０衄１／５４８砌处相对试剂空白测定荧光强度，值或扫描荧光光谱。５．３结果与讨论５．３．１阳离子表面活性剂与酸性染料单体的反应荧光素与ＴＢＦ是结构相近的酸性染料其与阳离子表面活性剂的反应很相似。以ＴＢＦ为例，不同浓度的表面活性剂与ＴＢＦ作用见图５．１，表明，在表面活性剂浓度很稀时阳离子表面活性剂与酸性染料形成离子对使染料荧光猝灭，直至全部消失。随着表面活性剂浓度增大，表面活性剂逐渐聚集形成胶束，染料荧光逐渐增加，达ＣＭＣ值时达到最大。ＣＴＭＡＢ，ＣＰＢ的ＣＭＣ值分别为：９．０×ｌＯ‘４ｍｏ儿【８９１，９．２ｘ１０。４ｍｏｌ／Ｌ【删即表面活性剂浓度大于ＣＭＣ时染料荧光强度最大且稳定。１．Ｏｏｏ．８０皇ｏ．６０ｏ．４８Ｏ．２０【ＣＡＳＳｌＯ．１｝ＩＭＴｈｅ（？ｏⅡｃｅｎｔｌ’ａｔｉｏｎＩＣＡＳＳｌＯ．１ｍＡＩｏｆ【（：ＡＳＳｌ图５．１荧光猝灭及新荧光产生的过程Ｆｉｇ．５—１１＇ｌｌｅｃｏｕｒｓｅｏｆｎｏｒｅｓｃｅｌｌｃｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ锄ｄ１．ＣＰＢ２．ＣＴＭＡＢｇｅｎｅ枷ｏｎｏｆｎｅｗｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．２９．河北大学理学硕＋学何论文５．３．２表面活性剂对能量转移体系的影响图５－２表面活性剂的浓度对能量转移的影响Ｆｉｇ．５．２Ｔｈｅｉｌｌｎｕｌ胁ｃｅｏｆＣＡＳＳｏｎ锄ｅｒｇｙ仃蛆ｓｆｅｒｓｙｓｔｅｍ：ｍｏｌ／Ｌ劬忸（ａ）ｔｏ（曲：ｔｌｌｅｃｏｎｃ既仃ａｔｉｏｎｏｆＣＭＴＡＢ（Ｏ．２，Ｏ．４，０．６，Ｏ．８，１．０，１．２，１．４）×１０‘３Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓｏｄｉｕｍ：５．０×１０’７ｍｏｌ／Ｉ。：ＴＢＦ：２．５×１０击ｍｏⅥ。由荧光素与ＴＢＦ的荧光光谱、吸收光谱可知，①：荧光素的九锄＝５２２沁ｍ＝５４８ｎｍ，ＴＢＦ的最大吸收波长为５１８ｎｍ，ＴＢＦ的ｎｍ与荧光素沁ｍ相差４眦，这样就为荧光素与ＴＢＦ间的能量转移提供了前提条件；②：混合体系的光谱是两者的简单叠加，即在无表面活性存在时，荧光素与ＴＢＦ间不发生有效的能量转移；③：选择ＴＢＦ吸收接近为零的波长４７０１１ＩＩｌ作为激发波长，既可保证荧光素有强荧光产生，又可使ＴＢＦ不被激发。为研究两染料间能量转移，固定荧光素与ＴＢＦ的用量，在体系中逐渐增加ＣＴＭＡＢ用量，结果见图５．２，表明：水溶液中混合体系的荧光谱只是两染料简单叠加，未有能量转移发生，随着ＣＴＭＡＢ用量的增加，染料间发生了有效的能量转移。能量转移效率叩可以由供体荧光的猝灭或受体荧光的增强，由公式【９１切＝Ｊ『一，幌得出（其中Ｆ为无给体时受体的荧光强度，凡为给体存在时受体的荧光强度）。绘制呀随表面活性剂浓度变化曲线图５．３表明：当浓度为６．Ｏ×ｌｏ．３ｍ０１／Ｌ时能量转移效率最大，浓度再增加时转移效率下降。由ＣｎｄＡＢ，ＣＰＢ的ＣＭＣ值可知能量转移效率最大时表面活性剂浓度在２／３ＣＭＣ处。第５章胶柬体系中荧光素‘ｊ四溴荧光素间能镑转移条件及模型研究１１ｌｅｃｏｎｃａｌ心ａｔｉｏｎｏｆＣ瞰ＡＢ（Ｏ。１１１ｌ蚤田ｍｅｅ衔ｃｉ锄ｃｙｏｆｅｎｅｒｇｙ图５．３表面活性剂的浓度对能量转移效率的影响Ｆｉｇ．５—３ＴｈｅｉｎｎｕｅｎｃｅｏｆＣＡＳＳ’ｓＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｃｏｎｃｅｌｌ妇ｔｉｏｎｏｎｔｍｓｆ打ｓｏｄｉ啪：５．０×１０’７ｍｏｌ／／Ｌ：ＴＢＦ：２．５×ｌｏ．６ｍｏｌ／Ｌ在２／３ＣＭＣ处分别换用阴离子表面活性剂ＳＤｓ、ＤＢｓ和非离子表面活性剂阿ｔｏＩⅨ．１００则未观察到能量转移现象。表明：在阴离子及非离子表面活性剂中，阴离子染料问不能发生能量转移现象。５．３．３荧光素与ＴＢＦ浓度对能量转移效率（，７）的影响在瑁最大的表面活性剂浓度时，固定荧光素的浓度，改变ＴＢＦ用量作图５．４，表明荧光素：ＴＢＦ＝１：３时呀达到最大。大于１：３时印值不变。本实验选ｌ：５为最佳比例即荧光素５．０×１０’６ｍｏｌ／Ｌ１．０ｍＬ，ＴＢＦ５．Ｏ×１０。５ｍｏｌ／Ｌ０．５ｍＬ为最佳用量。１：１０Ｔｈｅｌ：２２：ｌ４：１６：１８：ｌｍ０１盯ｒ撕ｏｎｂｅｔ诃ｅｅｎＴＢＦａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｍ图５４荧光素与四溴荧光素的浓度对能量转移效率的影响Ｆｉｇ．５４ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉＩｌｎｌｅｅｆ五ｃｉｅｎｃｙ．３ｌ一ｓｏｄｉ啪ａＩｌｄＴＢＦ’ｓｃｏｎｃｅｎ仃ａｔｉｏｎｏｆ锄ｅｒｇｙ仃觚ｓ缅ｏｎ河北大学理学硕十学位论文５．４能量转移模型随着表面活性剂浓度增大，当全部酸性染料与阳离子表面活性剂形成离子缔合物时荧光消失，量转移发生，提高表面活性剂浓度，此时未达到其临界胶束浓度，但浓度增大到一定值时将有部分表面活性剂开始聚集而形成胶束，电荷被中和的疏水性离子缔合物很易被胶束“萃取”。离子缔合物进入胶束后，可能会重新排列而形成荧光素、ＴＢＦ与表面活性剂组成的混合胶束。此时，染料的疏水基（头部）将面向水层并受到胶束正电荷的作用，而具有大共轭体系的主体部分将处于胶束的疏水芯部，见图５．５，正是这种胶束微环境拉近了能量给体与能量受体间的距离，而且使荧光增强。但此时叩值不是最大，且表面活性剂浓度继续增加时，受体荧光强度基本不变，此时胶束的增敏作用大于能量转移作用，表现为能量转移受体的荧光最强。甲Ｆ１ｌｌｏｒｅｓｃｅ豇ｌＴＢＦ零＞ＣＡＳＳ图５．５能量转移模型Ｆ培５－５ｎｅｍｏｄｅｌｏｆｅｎｅＦｇｙ嘶ｓ衙５．５结论低浓度染料分子间发生有效能量转移应具备以下条件（１）：两染料给体的发射波长．３２．第５章胶束体系中荧光素’丁四溴荧光素间能鞋转移条件及模型研究与受体的吸收波长差值尽量小；（２）：需在与染料带相反电荷的表面活性剂介质中进行；（３）：表面活性剂浓度应在ＣＭＣ以下且在２／３ＣＭＣ左右能量转移效率叩值最大；（４）：受体荧光强度受叩值及表面活性剂增敏作用共同影响，即荧光强度最大时表面活性剂浓度不一定等于２／３ＣＭＣ处值；（５）：两个带相反电荷染料间的能量转移机理及应用有待进一步研究。河北大学理学硕十学位论文参考文献【１】翁文婷．４，６－二溴荧光素荧光法测定微量铜离子的研究【Ｊ】．泉州师范学院学报（自然科学）．２００７，２５（２）：７ｌ￣７４．【２】陈兰化，严波．过氧化氢氧化二氯荧光素动力学荧光法测定痕量镍【Ｊ】．冶金分析．２００７，２７（１１）：４ｌ—４３．【３】傅丽，刘保生，曹冬林．四溴荧光素荧光猝灭法测定司帕沙星【Ｊ】．分析试验室．２００６，２５（１０）：６２一“．【４】范文秀，王泽云．２’，７’－二氯荧光素荧光光谱法测定食盐中的１０３’含量【Ｊ】．广东微量元素科学．２００６，１３（３）：５８～６１．［５】陈兰化，张英．溴酸钾氧化二氯荧光素催化荧光法测定痕量铬（Ⅵ）［Ｊ】．中国卫生检验杂志．２００５，ｌ５（４）：４４２￣４５２．［６】范文秀，张玉泉．２’，７’－二氯荧光素荧光光谱法测定饲料中微量总砷［Ｊ】．光谱实验室．２００５，２２（２）：３４７￣３４９．【７】臧运波，张爱梅．荧光素钠．Ｍｎ２＋．Ｈ２０２体系荧光法测定常见水果的抗氧化活性【Ｊ】．分析科学学报．２００５，２１（１）：８ｌ～８３．【８】占达东，王周平，吕家根．荧光素－ＧＯＤ－Ｈｌ冲荧光淬灭法测定植物果实组织中的葡萄糖含量【Ｊ】．海南大学学报自然科学版．２００４，２２（１）：５７～６０．【９】陈兰化，杨利青．过氧化氢氧化二氯荧光素动力学荧光法测定痕量铜［Ｊ】．分析试验室．２００３，２２（５）：３２～３４．【１０】齐香君，刘农南，范文杰，等．荧光素汞荧光熄灭法测定海带中微量碘【Ｊ】．光谱实验室．２００２，１９（６）：７２ｌ～７２４．【１１】郭畅，王伦．二溴荧光素荧光动力学分析法测定痕量钴【Ｊ】．安庆师范学院学报（自然科学版）．２００２，８（３）：２２￣２５．【１２】朱展才，朱红斌，汪静．异硫氰酸荧光素荧光法测定痕量铈【Ｊ】．分析化学．２００ｌ，２９（１０）：１２３４．【１３】朱展才，黄佳英，王佩珊．异硫氰酸荧光素荧光猝灭法测定痕量碘酸根［Ｊ】．分析测试技术与仪器．２０００，６（４）：２２５～２２７．【１４】李学强，龚波林．２’，７’一二氯荧光素荧光法测定环境样品中微量Ａｓ（ＩＩＩ）的研究【Ｊ】．光谱学与光谱．３４．参考文献分析．２０００，２０（３）：４２０￣４２２．【１５】李学强，田晓燕，龚波林．荧光素荧光法测定大气中ｓ０２的研究【Ｊ】宁夏大学学报（自然科学版）．１９９９，２０（４）：３３８～３３９．【ｌ叼Ｉ．Ｍｏｒｉ，ＹＦｑｉｔａ，Ｋ．Ⅱ【ｕｔａ，ｅｔａ１．ＨｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅＩｅｃｔｉｖｅｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｓｆ研ｍｅｄｅｔｅｒｍｉｌｌａｔｉｏｎｏｆｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ａｎｄｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＩ）ｕｓｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉＩｌ／ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ／ｔｒｉｅｍｌｅｎｅｔｅ协ａｍｉｎｅ锄ｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ］叭ｌｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ／ｔｒｉｅｔｈｌ—ｅｎｅｔｅ仃ａ【ｍｉＩｌｅ／ｔｉｒｏｎ，ｒｅＳｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［Ｊ】．Ｆ．ｒｅｓｅｎｉｕｓ７ＪｏｕｍａｌｏｆａＩｌａｌ舛ｃａｌＣｈｅｎｌｉｓｔ够１９８７，３３４（３）：２５２～２５５．【１７】Ｊｉａ—ＭｉＩｌｇＬｉｕ，“ａＩｌｇ·ＹｕｎＸｕ，Ｓｈｉ·ＲｏｎｇＨｕ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｓｏｌｉｄｏｆｇｌｕｃｏｓｅｂｙａｍｎ时ａｄｓｏｒｐｔ－ｉｏｎｌａ＿ｂｅｌ．ｅｄｗｉｍＳ１ｌｂｓ仃ａｔｅ—ｒ０锄帅ｅｒａｔｌｌｒｅｐｈｏｓｐｈ砥ｍｅ仃ｙａｓｂａｓｅｄｏｎｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｕｓｉｎｇ１．５一ｇｅＩｌｅｒａｔｉｏｎｄｅｌｌｄｒｉｍｅｒｓｓｅＩｌｓｉｔｉｚｅｒ［Ｊ】．ＭｉｃｒｏｃｈｉｍＡｃｔａ．２００８，１６ｌ（１）：２１７￣２２４．ｄｅｔｅｎｎｉｎａｔｉｏｎｏｆａｎｄ［１８】ｋＳｕｖａｒｄｈ船，ｋＳｕｒｅｓｌｌｌ（ｕｍａｒｑｕｉｎａｌｐｈｏｓｕｓｉＩｌｇｆｌｕｏｆｅｓｃｅｉｎｉＩｌ２００５，１０８（１—３）：２１７￣２２７．【ｌ９】ＫＡｔｓｌｌｌｌｉｌ【０Ｓａｔｏ髓ｄａｎｄＰ．Ｃｈｉｒａｎｊｅｅｖｌ．Ｅｘｔｍｃｔｉｖｅｓｐｅｃ的ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃｅｎｖｉｒｏ姗ｅｎｔａｌｓａｍｐｌｅｓ【Ｊ】．ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｏｎｉｔｏｍｇＡｓ∞ｓｓｍ∞ｔ．Ｊｕｎ－ｉｃｈｉＡｎｚａｉ．ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｇａｒＳｕｓｉｌｌｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄｃｏｎｃａｌｌａｖａｌｉｎＡ－ｇｌｙｃｏｇｅｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ【Ｊ】．ＡｍａｌＢｉｏ锄ａｌＣｌｌｅＩｎ．２００６，３８４（６）：１２９７￣１３０１．Ｈｏｎｇ【２０】ＹｉＩｌｇ－ＨｌｌａＤｅＩｌｇ，Ｈｕａ－Ｓｈ锄ｚｌｌａｎｇ锄ｄＷａｎｇ．Ｒａｐｉｄ觚ｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｍｉＩｌａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏ锄ｉＩｌｏａｃｉｄｓｉ１１ｐｈｏｓ访ｔｉｎｂｙＮ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｃａｐｉｌｌａ巧ｚｏｎｅｅｌｅｃ仃ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、）ｌ，ｉｍｌａｓ＊ｉＩｌｄｕｃｅｄ２００８，３９２（１－２）：２３１￣２３８．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ—Ｏ—ａｃｅｔａｔｅｉｌｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ】．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｌｎ．【２ｌ】Ｈ１ｌｌｌｔＡ．Ｌ，Ａｌｄ耐．Ｆ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｍ盯ｃｕｒｙ（ＩＩ）ａｃｅｔａｔｅ锄ｄｓｏｄｉ啪ｎｕｏｒｅｓｃｅｉＩｌ鸽ｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒｍｅａｃｔａ．ｄｅｔｅｎｎｍａｔｉｏｎｏｆｂｉｓ（２－ｃｈｌｏｒｏｅｍｙｌ）ｓｕｌｆｉｄｅｂｙｎｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ【Ｊ】．Ａｎａｌ”ｉｃａｃｈｉ—ｍｉｃａ１９９９，３８７（２）：２０７￣２１５．【２２】Ｇｕｏｈｕｉ删，Ｚｈ姐ｃａｉＺＨＵ锄ｄ‰协ｇＱＩＵ．ＡＦｌｕｏｒｏｍｅ翻ｃＭｅｔｈｏｄ蠡竹ⅡｌｅＤｅｔｅ肋ｉｌｌａｔｉｏｎｏｆｈＤｎ（ＩＩ）ｗｉｔｌｌＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＩｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ锄ｄＩｏｄｉｎｅ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉ肌ｃ船．２００２，１８（９）：１０５９￣１０６１．【２３】朱展才，林德娟，林进妹．用荧光素和碘测定抗坏血酸的研究［Ｊ】．分析测试技术与仪器．２００ｌ，７（１）：２７—３０．【２４】朱国辉，朱展才，薛珲，等．荧光猝灭测定痕量钯［Ｊ】．分析化学．２００３，３１（１）：４８～５１．【２５】魏琳琳．荧光分析测定苯酚新方法研究【Ｊ】．福建分析测试．２００７，１６（１）：１２～１４．．３５．河北大学理学硕一卜学位论文【２６】ＢａｏｌｉｎｇＹ．ｕａｎ，ＪｉｕｈｕｉＱｕａｎｄＱｉｎｇ瑚Ｌｉｌｌ．Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｏｆａｒｓｅｎｉｔｅａｎｄａｒｓ锄ａｔｅｉｎｗａｔｅｒｕｓｉｎｇｎｕｏｒｅｓｃｅｉｎａＩｌｄｉｏｄｉｎｅ【Ｊ】．ＩＩｌｔｅｎｌａｔｉｏｎａｌＪ０啪ａｌＥ州ｒｏ姗ｅｎｔａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈ啪ｉｓ略２００２，８２（１）：３ｌ～３６．【２７】Ｂ．Ｍａｌｌｉｅｕ）（ｅ，Ｍ．一Ｃ．Ｃａ玎６，Ｊ．－Ｃ．Ａｎｄｒ６，ｅｔａＬＮｉ仃ａｔｅｎｕｏｍｅｔｒｉｃ锄ａｌｙＳｉｓｕｓｉｎｇａＩｌａｃｔｉｖｅ０ｐｔｉｃａｌ助ｅｒ【Ｊ］．Ａｍａｌｕｓｉｓ．１９９９，２７（８）：７３５～７４１．【２８】司文会．核糖核酸与中性红作用机理及含量测定的研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００７，２７（６）：１１８１～１１８４．［２９】鲍所言，成永强，石生勋．中性红催化荧光法测定钒（Ｖ）【Ｊ】．河北大学学报（自然科学版）．２００３，２３（２）：１４４～１４６．［３０】李文友，吴会灵，何锡文，等．中性红荧光探针法测定生物大分子核酸【Ｊ】．高等学校化学学报．２００３，２４（１０）：１７８７一１７８９．【３ｌ】唐宏兵，王玉芳，葛态刚，等．中性红荧光熄灭法测定食品中亚盐【Ｊ】．江苏预防医学．２０００，１１（２）：６２～６３．【３２】任慧娟，符连社，张荣冬，等．中性红作试剂荧光光度法测定亚根［Ｊ】．分析化学．１９９８，２６（１０）：１２６４～１２６６．【３３】Ｄ．Ａ．Ｍｉｌ（ａｅｌｙ狮，Ｖ．ｚｈ．Ａｎｓｍｎｉ，＆Ｏ．Ｇｅｏｋｃｈｙ锄，ｅｔａ１．Ｓｏｌｖ锄ｔＥｘ咖ｃｔｉｏｎＦｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＴｌｌａｌｌｉ啪（ＩＩＩ）ｉｎＭ锄ｇ锄ｅｓｅｏｘｉｄｅＯ煅谢ｔｌｌａＮｅｕ仃ａｌＢ觞ｉｃＲｅｄＤｙｅ【Ｊ】．Ｊｏｕｎｌａｌ０ｆＡｎａｌ如ｃａｌＣｈ锄ｉｓ时．２００１，５６（４）：３６８～３６９．【３４】Ｔ．Ｙｂｓｈｉｄａ，Ｙ．Ｍｏｒｉｙａｍａ觚ｄＣｈｌｏｄｄｅ够ａＦｌｕｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅＨ．‰ｌｉｇｕｃｈｉ．昏Ｍｅｎｌｏｘｙ＿２一ｍｅｔｌｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎｅ＿４＿ｃａｒｂｏｎｙｌＲｅａｇｅｎｔ矗泔ＡｌｃｏｈｏｌｓｉｎＤ嘶ⅦｔｉｚａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅｓ．１Ｈｉｇｌｌ－Ｐｅｍ眦ｌａＩｌｃｅＬｉｑｕｉｄＣｌｌｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ【Ｊ】．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ９９２，８（３）：３５５～３５９．０ｐｔｏｄｅ【３５】Ｈｕｉ－ＨｕｉＺｅＩｌｇ，Ｋｂ—ＭｉｎＷ抽ｇ，ＤｏｎｇＬｉ，ｅｔａ１．ＤｅｖｅｌｏｐｍｃＩｌｔｏｆ孤ａｌｃｏｈｏｌｆｈｌｏｒｅｓｃｅＩｌｃｅｍｅｒｎｂｒ锄ｅｂ嬲ｅｄｏｎｅＩｌｌｌａｎｃ锄ｅｎｔｏｆｎｕｏｒｅｓｃｅｉＩｌｄｅｒｉｖａｔｉＶｅｓ【Ｊ】．ＴａｌａＩｌｔａ．１９９４，４１（６）：９６９￣９７５．【３６】Ｊ．Ｃ．Ｍｏｔｔｅ，Ｒ．Ｗ证ｄＴＢＦａｎｄｄｅｔｅｎＩｌｉｎａｔｉｏｎｏｆＡ．Ｄｅｌａｆ．ｏ—ｅ．Ｈｉ曲－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ），ｎｕｏ他ｓｃ饥ｃｅｄ丽Ｖａｔｉｚａｔｉｏｎ＿ｉｎａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎｆｏｒｌｌｌｅｌｉｑｕｉｄｈｙｄｒｏｘｙｃｏｍｐｏｕｎｄｓｂｙｈｉｇｌｌ－ｐ曲ｍ柚ｃｅｈｉｇｈ－ｐｅ响彻锄ｃｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ【Ｊ】．ＪｏｕｍａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ【３７】ＡｂｄｕｌｌａｈＩ．Ｈａｊ－Ｙｅｈｉａｃｈｒｏｍａｔｏ龋印ｈｙｗｉｕｌａｌｌｄＬｅｓｌｉｅ１９９６，７２８（１－２）：３３３—３４１．ｏｆａｌｃｏｈｏｌｓｂｙＺ．ＢｅＩｌｅｔ．Ｄｅｔ锄ｉＩｌａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｅｒｌｉｑｕｉｄｎｕ埘ｍｅｔｒｉｃｐｒｅｃｏｌ呦ｄ耐Ｖａｔｉｚａｔｉｏｎ谢ｔｈ２－（４．ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－．３６．参考文献６－ｍｅｍｏｘ）Ｉｂｅｎｚｏ如啪［Ｊ］．ＪｏｕｍａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏ蓼ａｐｈｙＡ．１９９６，７２４（１－２）：１０７～１１５．【３８】ＰｅｔｅｒＡｓｓａｆ，Ｊｅｈｏｓｈｕａ勋ｔｚｌｌｅｎｄｌｅｒ孤ｄｕｓｅ如ｌｍａｇｅｎｔＡｂｄｕｌｌａｈＩ．Ｈａｊ－Ｙｅｈｉａ．２一（４一Ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｌｌｙｌ）一６－Ｎ，ｆ．ｏｒｍｅｓｅｎｓｉｔｉＶｅｄｅｔｅｎｎｉＩｌａｔｉｏｎｏｆＮ－ｄｉｅｔｌｌｙｌ锄ｉＩｌｏｂｅＩ］ｌｚｏ如ｍｎ：ａｈｉ９１ｌ－ｐｅ响ｍ孤ｃｅｌｉｑｕｉｄｏｆａｌｃｏｈｏｌｓｂｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｎｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ【Ｊ】．ＪｏｕｍａｌｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ．２０００，８６９（１－２）：２４３以５０．【３９】颜梅，陈欣，孙舒婷，等．荧光光谱法研究二溴羟基卟啉与蛋白质的结合作用机理［Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００８，２８（６）：１３２２一ｌ３２６．［４０］Ｙａｎ—ＪｕｎＨｕ，ＹｉＬｉｕ，Ｘｕｅ－ＳｏｎｇＳｈｅＩｌ，ｅｔａ１．Ｓｔｌｌｄｉ豁０ｎｍｅｉｌｌｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌ－ｈｅｘｙｌｃａ而锄ｏｙｌ一５一ｆｌｕｏｒｏｕｒａｌｃｉｌａｎｄｂｏ恤ｅｓｅｍｍａｌｂｕｍｉｎ【Ｊ】．Ｊ０ｕｍａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳ缸１ｌｃｔｕｒｅ．２００５，７３８（１－３）：１４３～１４７．【４ｌ】杨曼曼，杨频，张立伟．荧光法研究咖啡酸类药物与自蛋白的作用【Ｊ】．科学通报．１９９４，３９（１）：３ｌ～３４．【４２】许金钩．荧光分析法【Ｍ】，第３版．北京：科学出版社．２００６：７２￣７５．【４３】Ｉ：印ｕｔｓｋａｙａ认，ＥｍｉｌｏｖＥＡ，Ｔ肌ｎｅｎＳ，ｅｔｋｉｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆａ１．ＴｈｅｉＩｌｎｕｅｎｃｅｏｆＦ６ｒｓｔｅｒｔｈｅｒｍａｌｌｙａｃｔｉＶａｔｅｄｅｎｅｒｇｙ觚ｌｓｆ．盯ｏｎｓｐｃｃ咖ｌ锄ｄｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ锄ｄｄｅｌａｙ司ｎｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｒｉｎ棚ｅｐ—ｂｅｉｎ印０１灿ｌｙｌａｌｃｏｈｏｌｍａｔｒｉｘ【Ｊ】．ＪＬ啪ｉｎｅｓｃ即ｃｅ．２００６，１２ｌ（１）：７５～８７．Ｐ吲ＳｗａｔｉＤｅ，Ａ盟ｉｓｈｗａｒＧｉｒｉｇｏｓｗａｍｉ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃ朗ｃｅｒｅｓｏｎ孤ｃｅｅＩｌｅｒｇｙ劬ｎｓｆ融—－ａｓｐｅｃ们ｓｃｏｐｉｃｆｏｒｏｒｇ锄ｉｚｅｄｓｕ】ｒｆ．ａｃｔａＩｌｔｍｅｄｉａ【Ｊ】．ＪｏｕｍａｌｏｆＣｏｌｌｏｉｄ锄ｄｈｌｔｅ而ｃｅＳｃｉｅｎｃｅ．２００４，２７ｌ（２）：４８５ｑ９５．【４５】江或，吴何珍，高峰，等．荧光素．酚藏花红荧光能量转移用于测定ｃｕ２＋【Ｊ】．化学研究与应用．２００５，１７（６）：７６弘７７１．【４６】李小燕，李树伟，潘建章，等．荧光共振能量转移体系测定ｃｒ（Ⅵ）的研究【Ｊ】．四川师范大学学报（自然科学版）．２００５，２８（６）：７１２￣７１４．【４７】刘保生，高静，杨更亮．吖啶橙一罗丹明６Ｇ能量转移荧光猝灭法测定维生素Ｂ１２【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００５，２５（７）：１０８０￣１０８２．【４８】刘保生，高静，杨更亮．吖啶橙一罗丹明６Ｇ荧光共振能量转移及罗丹明６Ｇ荧光猝灭测定蛋白质【Ｊ】．分析化学．２００５，３３（４）：５４缸５４８．［４９】鲍所言，王桂华，刘保生，等．ＰＡＲ．吖啶黄能量转移荧光猝灭法测定痕量铁（ＩＩ）的研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００ｌ，２ｌ（１）：８７～８９．【５０】欧阳运富，王永生，薛金花，等．吖啶橙－罗丹明６Ｇ共振能量转移荧光猝灭法测定尿中ｌ－羟基．３７—河：｛匕人学理学硕十学位论文芘【Ｊ】．分析试验室．２００７，２６（１１）：５３～５６．［５ｌ】曹冬林，刘保生，傅丽，等．吖啶橙－罗丹明６Ｇ能量转移荧光猝灭法定量测定茶多酚［Ｊ】．分析测试学报．２００７，２６（４）：５３７￣５４０．【５２】刘保生，王桂华，孙汉文，等．吖啶橙．罗丹明６Ｇ能量转移荧光法测定痕量磷【Ｊ】．分析化学．２００１，２９（１）：４２￣４４．［５３】刘保生，高静，刘智超，等．吖啶橙·罗丹明Ｂ荧光共振能量转移猝灭法测定砷【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００６，２６（２）：３０缸３０８．【５４】傅丽，刘保生，曹冬林，等．吖啶黄·罗丹明６Ｇ之间荧光能量转移及其在测定钒中的应用［Ｊ】．冶金分析．２００７，２７（７）：２“２９．【５５】李小燕，李树伟，曾铭，等．利用荧光共振能量转移体系测定食品中Ｎ０２。的研究【Ｊ】．分析试验室．２００６，２５（４）：３８￣４１．【５６】贺元文，吕吕银，张建文，等．罗丹明６Ｇ·ＰＡＮ能量转移荧光猝灭法测定痕量锰（ＩＤ【Ｊ】．中国卫生检验杂志．２００７，１７（５）：８２１～８２２．［５７】张建文，贺元文，吕吕银，等．罗丹明６Ｇ—ＰＡＮ能量转移荧光猝灭法测定痕量锌［Ｊ】．中国卫生检验杂志．２００７，ｌ７（６）：９９５￣９９６．【５８】米兰，武昆，高军彦，等．荧光共振能量转移测定牛血清白蛋白的研究阴．化学研究与应用．２００８，２０（２）：１８ｌ～１８３．［５９】李小燕，李树伟，曾铭，等．荧光共振能量转移测定杀虫单［Ｊ】．分析化学．２００６，３４（９）：１３５８．［６０】侯明，张静．荧光红一四溴荧光素能量转移及荧光猝灭法测定痕量铜（ＩＩ）的研究【Ｊ】．分析科学学报．２００４，２０（６）：６１９￣６２１．［６ｌ】陈鸿琪．荧光能量转移体系在生化分析中的应用．吖啶橙（ＡＯ）．中性红（ＮＲ）荧光探针测定ＤＮＡ研究【Ｊ】．化学研究与应用．２０００，１２（２）：１６４￣１６８．［６２】Ｂａｏｓｈ∞ｇ“ｕ，ｚｌｌｉｃｌｌａｏＬｉｕａｎｄＪｉｒ咯Ｇａｏ．Ｄｅｔｅ衄ｉＩｌａｔｉｏｎｏｆ蛔ｃｅｐｈｏｓｐｈｏｎｌｓｂｙ∞ｅＦｇｙｎｕｏｒｅｓｃｅｌｌｃｅｑｕｅＩｌｃｈｉｎｇｏｆｎ锄ｓ衙Ａ喇ｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ—Ｒｈｏｄ锄ｉＩｌｅＢ【Ｊ】．ｈｌｄｉ锄Ｊ０ｕｍａｌｏｆＣｈ锄ｉｓ仃ｙ．２００６，４５（１０）：２２３８～２２４１．【６３】ＢａｏｓｈｅＩｌｇＬｉｕ，ｚＩｌｉｃｈ∞“ｕ锄ｄＧａ０Ｊｉｎｇ．Ｆｌｕｏ陀ｓｃ饥ｃｅＲ船ｏｎ觚ｃｅＥｎｅｒ盱Ｔｒ－锄ｓｆｉ。ｒＡｃｒｉｄｉｎｅＢｅｔ、）ｌ，嘲Ｂ１２【Ｊ】．Ｏｒａｎｇｅ锄ｄＲｈｏｄ锄ｉｎｅＢ蛐ｄＡｎａｌ蜘ｃａｌＡｐｐＩｉｃ撕０ｎｏｎＤｅｔ锄ｉｎａｔｉｏｎｏｆＶｉｔ锄ｉＩｌＡｎａｌ蛳ｃａｌＬｅｎｅｒｓ．２００５，３８（９）：ｌ３６７～１３７７．．３８．参考文献［“】ＢａｏｓｈｅｎｇＬｉｕ，Ｚｈｉｃｈａ０Ｌｉｕ锄ｄＺｈａｏｚｌｌ锄Ｃａ０．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｌｌｃｅａｃｒｉｄｉＩｌｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅＩｌｅｒｇｙ仃ａｍｓｆ旨ｂｅｔ、）Ｉ，ｅｅｌｌｏｍｇｅａｎｄｒｈｏｄ锄ｉｎｅ６ＧａｎｄａｎａｌｙｃｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅＵｅｓｏｆｄｏｄｅｃｙｌｂｅｎｚｅｎｅｓｏｄｉ啪跚ｌｆｏｍａｔｅ［Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｍｉｎｅｓｃｅＩｌｃｅ．２００６，１１８（１）：９９～１０５．［６５】刘保生，孙化阳，刘智超，等．十二烷基苯磺酸钠胶束中吖啶橙与罗丹明６Ｇ间的能量转移机理研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００６，２６（１１）：２０９３～２０９６．【６６】刘保生，张彦青，王云科，等．胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００８，２８（７）：１６００～１６０２．【６７】马贵斌，高飞，任斌知，等．荧光法研究药物分子与人血清白蛋白的结合作用［Ｊ】．化学学报１９９５，５３（１２）：１１９３～１１９７．［６８】王敬政，贺吉香，江崇球．芦荟大黄素与血清白蛋白的反应研究［Ｊ】．分析化学．２００ｌ，２９（７）：７８２～７８４．【６９】王峰，黄薇，唐波，等．蒂巴因与牛血清白蛋白的相互作用【Ｊ】．分析化学．２００６，３４（增）：２３９～２４２．【７０】栾尼娜，吴锦绣，宋玉民，等．芦丁与血清白蛋白结合作用的热力学研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００８，２８（４）：８５乱８５９．【７ｌ】高甲友，张智敏，王银平，等．流动注射在线萃取荧光法测定痕量阳离子表面活性剂［Ｊ】．分析化学．２０００，２８（１）：１２４．【７２】程介克．单细胞分析［Ｍ】．北京：科学出版社，２００５：１３．【７３】马金石，成吴，张驿，等．新型绿色农药—光活化农药［Ｊ】．化学进展．１９９９，１ｌ（４）：３４ｌ～３４７．【７４】周自永主编．新编常用药手册【Ｍ】．北京：金盾出版社，１９８７，２９０．【７５】孙伟，丁雅勤，饶俊，等．中性红分光光度法测定肝素钠的研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００６，２６（７）：ｌ３２２￣ｌ３２５．【７６】毛平，黄晓兰，李翠贞，等．高效液相色谱法测定血浆肝素含量【Ｊ】．中华医学检验杂志．１９９５，１８（６）：３５８～３６０．ＡＡｍｄｏｆ０，ＨＭ【７７】ＳＷａｎｇ锄ｄＲＪＬｉｌｌｌｌａｒｄｔ．Ｄｉｓａｃｃｈ撕ｄｅＣ０ｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨ印ａ血ＳｕｌｆａｔｅＵｓｉＩｌｇＣａｐｉｌｌ哪ＺｏｎｅＥｌｅｃ觚ｐｈｏｒｅｓｉｓ【Ｊ】．ＡｎａｌＢｉｏｃｈ锄．１９９１，ｌ９９（２）：２４９￣２５５．Ｙ，ｅｔａ１．ＬｉＩｌｅａｒＳｗｅｅｐ【７８】ＳｕｎＷ，ＪｉａｏＫ，Ｈ柚ＪＶ．ｏｌｔ锄ｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅ衄ｉＩｌａｔｉｏｎ１４８．ｏｆＨ印ａｒｉｎＢａｓｅｄｏｎＩｔｓＩｎｔｅｍｃｔｉｏｎ谢ｍＮｅｕ舰ｌＲｅｄ［Ｊ】．Ａｎａｌ”ｉｃａｌＬｅｔｔｅｒｓ．２００５，３８（７）：１１３７～ｌ．３９．河北大学理学硕十学何论文【７９】ＬｉｕＳＰ，ＬｕｏＨＳｏｍｅＢａｓｉｃＱ，ＬｉＮＢ，ｅｔａ１．ＲｅｓｏｎａｌｌｃｅＲａｙｌｅ学ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇＳｔｕｄｙｏｆｔｈｅＩｎｔ哪ｃｔｉｏｎｏｆＨ印ａ咖诵ｔｌｌＤｉｐｈ铋ｙｌＮ印ｈｍｙｌｍｅｍ锄ｅＤｙｅｓ［Ｊ】．Ａｎａｌ．Ｃｈ锄．２００ｌ，７３（１６）：３９０７～３９１４．［８０】詹国庆，兰秋月．偶氮胂ⅡＩ．镧（Ⅲ）褪色光度法测定蛋白质【Ｊ】．分析试验室．２００６，２５（５）：９ｌ～９３．［８ｌ】赵长容，刘保生，张红医．酸性棕ＳＲ分光光度法测定血清白蛋白【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００５，２５（１）：９２～９４．【８２】刘典梅，李舒婷，赵书林．钡Ａ．偶氮氯膦ＩＩＩ络合物探针分光光度法测定蛋白质［Ｊ】．分析化学．２００４，３２（２）：１８７～１９０．［８３】魏琴，李燕，段彩虹，等．微乳液增敏高灵敏荧光光谱探针测定蛋白质的研究［Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００６，２６（１）：１０９￣１１２．【８４】邵辉莹，张爱梅．甲基蓝体系共振瑞利散射法测定蛋白质［Ｊ】．食品科学．２００６，２７（３）：１９虬２０１．［８５】刘保生，张红医，张红蕾，等．氯酚红一蛋白体系的共振光散射法定量测定蛋白质【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００３，２３（２）：２２９￣２３１．【８６】李树伟，李娜，赵风林，等．用铬黑Ｔ作为共振光散射探针测定蛋白质【Ｊ】．分析化学．２００２，３０（６）：７３２￣７３５．【８７】中华人民共和国卫生部医政司编．全国临床检测操作规程（第二版）【Ｍ】．南京：东南大学出版社，１９９７：１５７一１５８．【８８】卞伟，魏玉霞，卫艳丽，等．四溴荧光素与ＤＮＡ作用的研究【Ｊ】．光谱学与光谱分析．２００６，２６（１）：１２５～１２９．【８９】Ｍ勰ａａｋｉＹａｍａｄａ，ＳｈｉｇｅｔａｋａＳｕｚｕｋｉ．Ｍｉｃｅｌｌ盯ＥＩ山锄ｃｅｄｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｎｎｉｎａｔｉｏｎｏｆｌ～２６３．Ｃｈ锄ｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｌｌｃｅｏｆｌ，ｌＯ—Ｐｈ吼锄缸‘ｏｌｉｎｅＵｌ仃ａ仃孔铭ｏｆＣｏｐｐｅｒ（ＩＤｂｙＦｌｏｗⅫｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ【Ｊ】．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｅｔｌ懿．１９８４，１７（４）：２５【９０】杨文初，周华方．季胺盐型表面活性剂与镁试剂Ｉ显色反应的研究及其分析应用【Ｊ】．分析化学．１９９５，２３（７）：７７５￣７７８．【９ｌ】ＳｅｌｖｉｎＰＲ，ＭｅｔｌＩＥｎｚ弘∞１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒ髂０ｎａＩｌｃｅｅｎｅｒｇｙ昀ｎｓ矗玎［Ｊ】．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ聊ｎ０１．１９９５，２４６（４）：３００￣３３４．．４０．附录附录在读期间发表的学术论文１．刘保生，张彦青，王云科，吕运开．胶束体系中荧光素与四溴荧光素间能量转移条件及模型研究［Ｊ】光谱学与光谱分析２００８，２８（７）：１６００—１６０２２．陈玉海，张彦青，赵风利，刘保生．荧光法研究左氧氟沙星与人血清白蛋白作用机理及含量测定【Ｊ】光谱实验室２００８，２５（２）：１８５一１８９３．刘保生，王云科，张彦青，傅丽，吕运开．铽．环丙沙星与罗丹明Ｂ间稀土敏化荧光能量转移机理研究【Ｊ】光谱学与光谱分析２００８，２８（１）：１５３－１５５４．刘保生，王云科，张彦青，吕运开．铽．环丙沙星稀土敏化荧光猝灭法测定叶酸［Ｊ】分析化学２００７，３５（７）：１０６７．１０７０５．国占生，赵风利，张彦青，刘保生．荧光黄荧光法测定香烟中尼古丁的含量［Ｊ】衡水‘学院学报２００９，１１（１）：２４．２６６．刘保生，赵风利，张彦青．流动注射化学发光能量转移法测定维生素Ｂ１［Ｊ】河北大学学报（自然科学版）２００８，２８（６）：６２５—６２８河北大学理学硕十学何论文致谢本论文是在我的导师刘保生研究员悉心指导下完成的。在论文完成过程中，无论从论文选题、实验设计，还是论文的撰写、修改，到最后校对，无不凝聚着刘老师的大量心血和汗水。刘老师严谨的治学态度、渊博的知识，专注的工作精神，敏锐开阔的科研思维深深影响着我。在求学期间，使我增长了专业知识，提高了的科研能力和工作能力，这一切将使我受益终生。在此，向给予我悉心培养和不倦教诲的敬爱导师致以衷心的感谢。感谢周建科老师、吕运开老师、郭志峰老师、仇满德老师在我完成论文工作期间给予的大力支持和帮助。感谢我尊敬的父母和家人在我求学过程中给予的关爱、支持和鼓励。张彦青河北大学化学与环境科学学院２００９年６月荧光素及中性红染料间能量转移机理研究及其分析应用

作者：

学位授予单位：

张彦青河北大学

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1635497.aspx