食醋总酸度的测定

为了提高教学质量，保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：

l、每次实验前必须详细预习实验讲义，明了实验目的、原理方法及操作步骤，并在记录本上拟出简单的实验原理、使用方法及操作时的注意事项。

2、在实验过程中，要听从老师的指导，严格按照实验步骤进行，不能任意更改，不熟悉的仪器设备，应先请老师指导后使用，切勿随意乱动。

3、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，思考加以解决，努力培养分析问题和解决问题的能力，如自己不能解决可与指导老师共同讨论研究，提出解决问题的办法。

4、实验进行时，必须随时把观察到的现象和实验数据，如实地记录在记录本上，不得记在散页纸上，要养成良好的作原始记录的习惯。

5、环境和仪器的清洁整齐是搞好实验的重要条件，实验台面试剂药品架上必须保持整洁，仪器药品要井然有序，所用的试剂，用完应立即盖严放回原处。注意瓶塞切勿张冠李戴。勿使试剂药品洒在实验台面和地上。实验完毕后，需将药品试剂排列整齐，仪器设备要恢复原状。将实验台面打扫干净，经教师验收仪器后，方可离开实验室。 6，必须遵守实验室的规则：

(1)室内不得高声谈笑，必须保持安静的实验环境。

(2)爱护仪器，不浪费药品，节约水电，遵守实验室的安全措施。 (3)滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废物缸，切勿丢入水池内。 (4)公用仪器如有损坏，应自行登记，并立即向指导老师报告。

(5)保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，不得乱放在实验桌上。

(6)实验室内一切物品，未经实验室负责老师批准严禁带出室外，借物必须办理登记手续。

(7)每次实验后由班长安排同学轮流值日，值日要负责当天实验室的卫生，安全和一些服务性工作。最后离开实验室时，应检查水、电、门窗等是否关闭。 (8)对实验的内容和安排不合理的地方可提出改进意见．对实验中出现的一切反常现象应进行讨论，并大胆提出自己的看法，做到生动活泼，主动地学习。

7、实验室禁止吸烟。

实验记录及实验报告

一、实验记录：

实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤简单扼要地写在记录本上。

实验记录本应标上页数，不要撕去任何一页，更不要擦抹及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须用钢笔或圆珠笔。

实验中观察到的现象，结果和数据应及时如实地记在记录本上。绝对不可以用单片纸做记录或草稿。原始记录必须准确、简练详尽、清楚。从实验开始就应养成这种良好的习惯。

记录时应做到正确记录实验结果，切勿夹杂主观因素，这是十分重要的，在含量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数、分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050不应写成0.05 每一个结果最少要重复观测两次以上。当符合实验要求并确知仪器工作正常后写在记录本上。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测量结果。所以，重复观测时即使数据完全相同也应如实记录下来，数据的计算也应该写在记录本的第一页上，一般写在记录右边的一页。总之实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。

实验中使用仪器的类型，编号以及试剂的规格、化学式、分子量准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验时，进行核对和作为查找失败原因的参考依据。 如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验．因为不可靠的结果当做正确的记录，在实验工作中可造成难以估计的损失。所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。 二、实验报告：

实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告，报告的形式可参照下列方式：

实验(编号) 实验名称 一、目的和要求： 二、原理：

三、试剂配制仪器： 四、操作步骤：

五、实验结果(数据记录及处理)： 六、讨论：

在实验报告中，目的和要求、原理以及操作步骤部分应简单扼要的叙述。但是，对于实验条件(试剂配制及仪器)和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳，分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格，标准曲线图以及比较实验组与对照实验结果的图表等。另外，还针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。

实训项目二 电位滴定法测食醋的总酸度 检查预习情况： 检查预习笔记 总结上次实验： 食醋的主要成分是醋酸，此外还含有少量其它弱酸，如乳酸等。采用电位滴定法，以玻璃电极为指示电极，饱和甘汞电极作参比电极，与试液组成工作电池。用NaOH标准溶液对试液进行电位滴定，通过测量工作电池的电动势随加入滴定剂体积的变化情况，绘制△E1 – 目的要求 (1) 学习电位滴定装置的安装与操作； (2) 初步掌握利用图解法确定滴定终点。 实验用品 滴定分析仪器 酸度计 复合电极 电磁搅拌器草酸标准溶液V工作曲线、确定滴定终点。再根据滴-1-1（0.1000 mol·L） NaOH溶液（0.1 mol·L ，准确浓度待标定） 定剂的浓度、终点时消耗滴定剂的体积-1和试液的取用量，求出食醋的总酸度。 食醋（~0.05 g·mL） 实验步骤 (1) 安装与调试仪器 安装仪器，调好零点 (2) NaOH溶液的标定 ① 粗测 5.00 mL草酸标准溶液→100 mL烧杯→30 mL水→放入搅拌子→开动搅拌器→滴定→测量电位值 ② 精测 5.00 mL草酸标准溶液→100 mL烧杯→30 mL水→放入搅拌子→开动搅拌器→滴定→测量电位值→记录→计算 (3) 食醋总酸度的测定 5.00 mL食醋试液→100 mL容量瓶→定容→摇匀 吸取试液10.00 mL→100 mL烧杯→30 mL蒸馏水→电位滴定 数据记录与处理 (1) 参照下表记录并整理标定NaOH溶液及测定食醋总酸度的数据 以玻璃电极为指示电极，以饱和甘汞电极作参比电极，将酸度计“功能开关”拨至mV档。按图5-16 安装仪器，调好零点。 准确吸取草酸标准溶液5.00 mL，置于100 mL烧杯中，加30 mL水，放入搅拌子。将待标定的NaOH溶液装入滴定管中，液面调至0.00 mL处，开动搅拌器，开始滴定。测量在加入NaOH溶液0、1、2直至10 mL后各个点的溶液电位值，初步判断发生pH突跃时所需NaOH溶液的体积范围。 重复粗测实验步骤的操作，但在预计的化学计量点附近取较小的等体积增量，增加测量点的密度（如果在粗测时突跃发生在8~9 mL，则在精测时以0.10 mL为体积增量来加入NaOH溶液，即测量加入8.00、8.10、8.20 … 直至9.00 mLNaOH溶液时各点的电位值）。记录每次加入滴定剂后的总体积V和对应的电位值E，计算出连续增加的电位值△E1和 △E1 之间的差值△E2。△E1 的最大值即为滴定终点，终点后再继续记录一、二个电位值。 V/mL (2) 绘制△E1 – V工作曲线 以加入的滴定剂体积V为横坐标，以测算的电位值增量△E1为纵坐标绘制△E1 – V工作曲线，确定滴定终点时消耗NaOH溶液的体积。 (3) 计算NaOH标准滴定溶液的浓度 E/mV △E1/mV △E2/mV 吸取食醋试液5.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用新煮沸并冷却的蒸馏水稀释至刻度，摇匀。吸取稀释后的试液10.00 mL，置于100 mL烧杯中，加入30 mL新煮沸并冷却的蒸馏水，仿照用草酸标准溶液标定NaOH溶液时的粗测和细测步骤，用已标定的NaOH标准滴定溶液对食醋试液进行电位滴定。 注意事项： (1) 食醋中HAc的浓度较大，颜色较深，必须稀释后方可测定。 (2) 测定醋酸含量时，所用蒸馏水不能含有CO2，因为CO2溶于水生成的H2CO3会同时被滴定，从而影响测定的准确性。 思考题： (1) 在标定NaOH溶液浓度和测定食醋的总酸度时，为什么都采用了粗测和精测两个步骤? (2) 试以计算法求出滴定终点时消耗滴定剂的体积，并与滴定曲线法比较其准确性。 (3) 为什么在离化学计量点较远时，每次加入较多的滴定剂，而接近化学计量点时，每次仅加入0.10 mL滴定剂? 0.10005.00103c (NaOH) = V式中 c (NaOH) —— NaOH标准滴定溶液的实际浓度，mol·L-1 ； V —— 标定消耗NaOH溶液的体积，L ； 0.1000 —— 草酸标准溶液浓度，mol·L-1 ； 5.00×10-3 —— 草酸标准溶液的体积，L 。 (4) 计算食醋的总酸度（以HAc的质量浓度计） c（NaOH）V60.06ρ(HAc) = 105.00103100式中 c (NaOH) —— NaOH标准滴定溶液的实际浓度，mol·L-1 ； V —— 测定消耗NaOH标准滴定溶液的体积，L ； 60.06 —— HAc的摩尔质量，g·mol-1 ； 10—— 食醋试液的体积，L 。 5.00101003 作业： 实验报告

实训项目三 豆浆中蛋白质含量的检测 检查预习情况： 检查预习笔记 目的要求  了解食品中蛋白质含量测定的几种常用方法，并能通过对各种方法的优缺点比较，选出较合适的测定方法。  理解并掌握国标——凯氏定氮法的原理及操作要点。  掌握凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能。  了解食品行业蛋白质检测的现状，并能提出个人的合理化建议。 实验原理  问题1：蛋白质作为食品的重要营养成分，其含量多少是食品是否具有营养的指标之一，现有的检测蛋白质的方法有几种？  问题2：凯氏定氮法的检测原理？ 实验用品 学生根据需要自行准备 实验步骤  问题3：简述检测步骤？  问题4：消化过程能否采用其他的处理方式？ 问题1：目前常用的有四种古老的经典方法：凯氏定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin -酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法，考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度高，比紫外吸收法高10-20倍，比Biuret法高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准确，往往以凯氏定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。而1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到越来越广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。具体上述几种测定方法的优缺点总结如下表所列。由于现行国标的测定方法仍然是凯氏定氮法，所以本项目我们仍用此法完成。 问题2：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸氨，经强碱碱化使之分出氨，借水蒸汽蒸馏将氨蒸至硼酸吸收液中，再以标准盐酸溶液滴定，即可计算得样品氮的含量。 问题4：可采用微波消解法。 问题5：H2SO4的作用是应用其脱水性和氧化性将蛋白质消化成无机铵盐。 K2SO4的作用提高溶液的沸点，加快蛋白质的分解。 问题6：①所用试剂应用无氨蒸馏水配制。 ②含脂肪、糖较多的样品可加消泡剂（液体石蜡或硅油）。 ③蒸馏装置的气密性要好，避免氨气泄漏。 ④硼酸吸收液的温度不宜过高（＜40℃），必要时可用冷水浴。 ⑤该操作应在通风橱内进行，凯氏定氮瓶的瓶口不得对着人。 ………………  问题5：消化过程中，H2SO4、K2SO4、CuSO4的作用各是什么？ CuSO4的作用是催化剂和指示剂。  问题6：该检测过程中有哪些注意事项？（集思广益，多多益善） ………… 处理数据  问题7：食品中蛋白质含量的计算方法？ 深思  问题8：食品行业现行蛋白质测定方法？分析为什么会出现“三聚氰胺”事件？  问题9：有无解决对策杜绝“三聚氰胺”事件再次发生？ 措施一：为堵住不法分子瞄准检验标准漏洞掺杂使假，据中国标准化研究院食品与农业所副研究员许建军博士透露，国家标准委正在组织制订检测方法国家标准，即食品中三聚氰胺测定方法。据了解，根据《食品卫生法》的规定和不同年龄阶段的婴幼儿对营养物质的需要，我国对婴幼儿配方奶粉制定了《婴儿配方奶粉1》、《婴儿配方奶粉11、111》和《婴幼儿配方奶粉及婴幼儿补充谷粉通用技术条件》3个强制性国家标准，详细规定了婴幼儿配方奶粉的原料、感官、理化指标、卫生指标等方面的要求。企业严格按照法律法规和标准组织生产，是可以确保产品质量和安全的。 措施二：采用先进的蛋白质分析仪。 美国CEM 公司的真蛋白质SPRINT分析仪，是目前唯一的真蛋白质测试仪，其主要特点： 1.直接测量“真蛋白质”，而非总氮含量 2.所有类型样品检测（液体、固体、粉末状、奶油、肉类、坚果类、谷物、种子等）； 3.测量时间只需两分钟；全自动操作，无需有经验的化学家； 4.对三聚氰胺等非法添加剂，不会产生错误的蛋白质测量结果,精确性和准确度等优于凯氏定氮法； 5.对非氮蛋白质的测定无需校准，直接测量； 6.无需化学试剂；相比目前的检测方法，具有更低的操作成本。 问题7： 样品粗蛋白含量＝总氮量× 6.25 6.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，我们取蛋白质平均含氮量为16％，计算出蛋白质换算系为6.25。但是不同种类食品的蛋白质种类不同，所以其换算系数由微小差异。乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。 问题8：我国现行的蛋白质的检验方法属于普通的全氮测定法，是按《食品中蛋白质的测定方法》（GB/T5009.5）进行检测，这种检测方法根据蛋白质是含氮的有机化合物，先测定食品中氮的含量，再将检测出的含氮量乘以含氮系数，所得结果即被认为是蛋白质含量。因此这是一种间接推定法。 三鹿事件中，三鹿集团固然难辞其咎，同时也说明目前的食品蛋白质检测方法是有问题的。三聚氰胺分子中含有大量氮元素。用普通的全氮测定法检测饲料和食品中的蛋白质数值时，根本无法区分这种伪蛋白氮。不法商贩将三聚氰胺添加到原料奶中，可以提高检测时所谓“蛋白质”的检测数值。可惜现在大多数企业在收购原料奶时，所用的检测设备无法甄别这种“伪蛋白”，必须要用进口的设备，而这种设备价格昂贵，许多企业尚未配置。 作业： 完成实验报告

实训项目四 食品中灰分的测定

一、目的和要求：

1、明确灰分的测定与控制成品质量的关系。 2、明确灰化条件与样品组分的关系。 3、掌握食品的基本灰化方法。 二、原理：

食品经灼烧后所残留的无机物质称为灰分，灰分采用灼烧重量法测定。 三、仪器： 高温炉

四、操作方法：

1、取大量适宜的瓷坩埚置高温炉中，在600℃下灼烧0.5小时，冷至200℃以下后取出，放入干燥器中冷至室温，精密称量，并重复灼烧至恒量。 2、加入2-3克固体样品或5-10克液体样品后，精密称量．

3，液体样品须先在沸水浴上蒸干，固体或蒸干后的样品，先以小火加热使样品充分炭化至无烟，然后置高温炉中，在550—600℃灼烧至无炭粒，即灰化完全。冷至200℃以下后取出放入干燥器中冷却至室温，称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5mg为恒量。

计算： m1-m2 X=------------ X 100 M3-m2 x-样品中灰分的含量，％； m1-坩埚和灰分的质量，g； m2-坩埚的质量，g； m3-坩埚和样品的质量，g。

实训项目五 气相色谱法测定食品中有机磷农药残留量

一、目的与要求

1．掌握气相色谱仪的工作原理及使用方法。 2．学习食品中有机磷农药残留的气相色谱测定方法。

二、原理

食品中残留的有机磷农药经有机溶剂提取并经净化、浓缩后，注入气相色谱仪，气化后在载气携带下于色谱柱中分离，由火焰光度检测器检测。当含有机磷的试样在检测器中的富氢焰上燃烧时，以HPO碎片的形式，放射出波长为526nm的特性光，这种光经检测器的单色器（滤光片）将非特征光谱滤除后，由光电倍增管接收，产生电信号而被检出。试样的峰面积或峰高与标准品的峰面积或峰高进行比较定量。 三、仪器与试剂

（一）仪器

1．气相色谱仪：附有火焰光度检测器（FPD）。 2．电动振荡器 3．组织捣碎机 4．旋转蒸发仪 （二）试剂 1．二氯甲烷 2．丙酮

3．无水硫酸钠：在700℃灼烧4h后备用。 4．中性氧化铝：在550℃灼烧4h。 5．硫酸钠溶液

6．有机磷农药标准贮备液：分别准确称取有机磷农药标准品敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷各10.0mg，用苯（或三氯甲烷）溶解并稀释至100mL，放在冰箱中保存。

7．有机磷农药标准使用液：临用时用二氯甲烷稀释为使用液，使其浓度为敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷、甲拌磷每毫升各相当于1.0μg，稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷每毫升各相当于2.0μg。 四、实验步骤

（一）样品处理

1．蔬菜：取适量蔬菜擦净,去掉不可食部分后称取蔬菜试样，将蔬菜切碎混匀。称取10.0g混匀的试样，置于250mL具塞锥形瓶中，加30g～100g无水硫

酸钠脱水，剧烈振摇后如有固体硫酸钠存在，说明所加无水硫酸钠已够。加0.2g～0.8g活性炭脱色。加70mL二氯甲烷，在振荡器上振摇0.5h，经滤纸过滤。量取35mL滤液，在通风柜中室温下自然挥发至近干，用二氯甲烷少量多次研洗残渣，移入10mL具塞刻度试管中，并定容至2mL，备用。

2．谷物：将样品磨粉（稻谷先脱壳），过20目筛，混匀。称取10g置于具塞锥形瓶中，加入0.5g中性氧化铝（小麦、玉米再加0.2g活性炭）及20mL二氯甲烷，振摇0.5h，过滤，滤液直接进样。若农药残留过低，则加30mL二氯甲烷，振摇过滤，量取15mL滤液浓缩，并定容至2mL进样。

3．植物油：称取5.0g混匀的试样，用50mL丙酮分次溶解并洗入分液漏斗中，摇匀后，加10mL水，轻轻旋转振摇1min，静置1h以上，弃去下面析出的油层，上层溶液自分液漏斗上口倾入另一分液漏斗中，当心尽量不使剩余的油滴倒入（如乳化严重，分层不清，则放入50mL离心管中，于2500r/min转速下离心0.5h，用滴管吸出上层清夜）。加30mL二氯甲烷，100mL50g/L硫酸钠溶液，振摇1min。静置分层后，将二氯甲烷提取液移至蒸发皿中。丙酮水溶液再用10mL二氯甲烷提取一次，分层后，合并至蒸发皿中。自然挥发后，如无水，可用二氯甲烷少量多次研洗蒸发皿中残液移入具塞量筒中，并定容至5mL。加2g无水硫酸钠振摇脱水，再加1g中性氧化铝、0.2g活性炭（毛油可加0.5g）振荡脱油和脱色，过滤，滤液直接进样。如自然挥发后尚有少量水,则需反复抽提后再如上操作.

（二）色谱条件

1．色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长1.5m～2.0m。 （1）分离测定敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷的色谱住

①内装涂以2.5％SE－30和3％QF－1混合固定液的60目～80目Chromosorb W AW DMCS；

②内装涂以1.5％OV－17和2％QF－1混合固定液的60目～80目Chromosorb W AW DMCS；

③内装涂以2％OV－101和2％QF－1混合固定液的60目～80目Chromosorb W AW DMCS。

（2）分离测定甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷的色谱住

①内装涂以3％PEGA和5％QF－1混合固定液的60目～80目Chromosorb W AW DMCS；

②内装涂以2％NPGA和3％QF－1混合固定液的60目～80目Chromosorb W AW DMCS；

2．气流速度：载气为氮气80mL/min；空气50mL/min；氢气180mL/min（氮气、空气和氢气之比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）。

3．温度：进样口：220℃；检测器：240℃；柱温：180℃，但测定敌敌畏为130℃。

（三）测定

将有机磷农药标准使用液2μL～5μL分别注入气相色谱仪中，可测得不同浓度有机磷标准溶液的峰高，分别绘制有机磷农药质量-峰高标准曲线。同时取试样溶液2μL～5μL注入气相色谱仪中，测得峰高，从标准曲线图中查出相应的含量。

五、结果计算

按下式计算：X式中：

X——试样中有机磷农药的含量，单位为mg/Kg；

A——进样体积中有机磷农药的质量，由标准曲线中查得，单位为ng； m——与进样体积（μL）相当的试样质量，单位为g。 计算结果保留两位有效数字。 六、注意事项

1. 本法采用毒性较小且价格较为便宜的二氯甲烷作为提取试剂,国际上多用乙氰作为有机磷农药的提取试剂及分配净化试剂,但其毒性较大。 2. 有些稳定性差的有机磷农药如敌敌畏因稳定性差且易被色谱柱中的担体吸附，故本法采用降低操作温度来克服上述困难。另外，也可采用缩短色谱柱至1-1.3米或减少固定液涂渍的厚度等措施来克服。

七、思考题

1．本实验的气路系统包括哪些，各有何作用？

A

m10002．电子捕获检测器及火焰光度检测器的原理及适用范围？ 3．如何检验该实验方法的准确度？如何提高检测结果的准确度？

实训项目六 鱼体中组胺的测定

本方法适用于蓝圆鲹(池鱼)、鲐鱼。 一、原理

鱼体中组织胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。最低检出浓度为5mg/100g。

二、试剂： 正戊醇；三氯乙酸溶液(100g/L)；碳酸钠溶液(50g/L)；氢氧化钠溶液(250g/L)；盐酸(1＋11)；组织胺标准溶液：准确称取0.2767g于100±5℃干燥2h的磷酸组织胺，溶于水，移入100mL容量瓶中，再加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1.0mg组织胺；磷酸组织胺标准使用液：吸取1.0mL组织胺标准溶液，置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于20μg组织胺；偶氮试剂；甲液：称取0.5g对硝基苯胺，加5mL盐酸溶液溶解后，再加水稀释至200mL，置冰箱中；乙液：亚钠溶液(5g/L)，临用现配。

甲液5mL、乙液40mL混合后立即使用。 三、分析步骤 1、样品处理

称取5.00～10.00g切碎样品，置于具塞锥形瓶中，加入15～20mL三氯乙酸溶液(100g/L)，浸泡2～3h，过滤。吸取2.0mL滤液，置于分液漏斗中，加氢氧化钠溶液(250g/L)使呈碱性，每次加入3mL正戊醇，振摇5min，提取三次，合并正戊醇并稀释至10.0mL。吸取2.0mL正戊醇提取液于分液漏斗中，每次加3mL盐酸(1＋11)振摇提取三次，合并盐酸提取液并稀释至10.0mL。备用。 2、测定

吸取2.0mL盐酸提取液于10mL比色管中。另吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mL组织胺标准使用液(相当于0、4、8、12、16、20μg组织胺)，分别置于10mL比色管中，加水至1mL，再各加1mL盐酸(1＋11)，样品与标准管各加3mL碳酸钠溶液(50g/L)，3mL偶氮试剂，加水至刻度，混匀，放置10min后用1cm比色杯以零管调节零点，于480nm波长处测吸光度，绘制标准曲线比较，或与标准系列目测比较。

3、计算

(A/1000)*100 X =

M * (1/V)*(1/10)*(1/10)

式中：X1——样品中组织胺的含量，mg/100g； V1——加入三氯乙酸溶液(100g/L)的体积，mL； m1——测定时样品中组织胺的质量，μg； m2——样品质量，g。

结果的表述：报告算术平均值精确至小数点后一位。 四、允许差

相对相差≤10%。

实训项目七（1） 水中细菌总数的测定

一、目的要求

1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理

本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材

肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；

灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 1．水样的采取

（1）自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

（2）池水、河水或湖水应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 2．细菌总数测定 （1）自来水

（a）用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 （b）分别倾注约15ml已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

（c）另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，作空白对照。

（d）培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24小时，进行菌落计数。 两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。 （2）池水、河水或湖水等

（a）稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30—300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。

（b）自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

（c）各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

（d）凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。 3．菌落计数方法

（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，

则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表ⅪⅤ-1，例1）。

（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30—300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数（见表ⅪⅤ-1，例2及例3）。

（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例4）。

（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例5）。

（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表ⅪⅤ-1，例6）。

五、实验报告 1．结果 （1）自来水

（2）池水、河水或湖水等

2．思考题

（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？ （2）你所测的水源水的污秽程度如何？

实训项目七（2） 多管发酵法测定水中大肠菌群

一、目的要求

1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。 2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 二、基本原理

多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。 1．初（步）发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。 2．平板分离

平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo＇s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blueagar，EMB agar），前者含有碱性复红染

料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。 3．复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 三、器材

乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水； 载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 1．水样的采取 同实验五十九。 2．自来水检查

（1）初（步）发酵试验在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样（如图ⅩⅣ-1）。混匀后，37℃培养24小时，24小时未产气的继续培养至48小时。

（2）平板分离经24小时培养后，将产酸产气及48小时产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养 18—24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 （a）深紫黑色、有金属光泽。 （b）紫黑色、不带或略带金属光泽。 （c）淡紫红色、中心颜色较深。

（3）复发酵试验经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1—3个， 37℃培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表ⅩⅣ-2，即得大肠菌群数。

3．池水、河水或湖水等的检查 （1）将水样稀释成10-1与10-2。

（2）分别吸取1ml10-2、10-1的稀释水样和1ml原水样，各入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有 5 ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。 （3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。

（4）将100、10、1、0．1（10-1）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-3，将10、1、0．1（10-1）、0．01（10-2）ml水样的发酵管结果查表ⅪⅤ-4，即得每升水样中的大肠菌群数。

五、实验报告 1．结果 （1）自来水

100ml水样的阳性管数是多少？ 10ml水样的阳性管数是多少？

查表ⅪⅤ-2得每升水样中大肠菌群数是多少？ （2）池水、河水或湖水

阳性结果记“+”；阴性结果记“-”。

查表ⅪⅤ-3得每升水样中大肠菌群数是多少？ 查表ⅪⅤ-4得每升水样中大肠菌群数是多少？

2．思考题

（1）大肠菌群的定义是什么？

（2）为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？ （3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？ （4）经检查，水样是否合乎饮用标准？