细菌室抗菌药物敏感试验作业指导书
若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小，来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。WHO推荐琼脂扩散法敏感试验(改良Kirby-Bauer法)，简称K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
1、试验用材料 1.1、培养基
Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，
维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。在水平的实验台上倾制。琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
1.2、药物纸片
抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。用以下两个指标判定纸片的质量：
①片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。 35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。
②准确度：判定纸片的实际含药量与标量是否一
致。
纸片的合理保存十分重要。药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，容易潮解。
细菌实验室应按临床的需要，决定敏感试验抗菌药物的种类。同类抗菌药物仅选用一个代表。应根据测定细菌的属种选药。
1.3、质控菌株
K-B法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。测定 MH琼脂是否适合做磺胺类试验，须用粪链球菌ATCC 29212或33186。上述质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。常规质量控制菌株应每月更换1次。
质控菌株简便保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取1支，传种细菌供常规使用。待用剩至最后1支，再传代在M-H平板上，接种一批高层琼脂管备用。如此连续可避免原始菌种
不接触抗生素，以防变异。
1.4、菌液比浊管
为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。采用比浊的办法控制菌悬液浓度。接种菌液浓度为 1.5×l08/m1，浊度相当于麦氏标准比浊管第1号管的1/2。
比浊管配法如下：
0.048mol/L BaCl2 0.5ml 0.18mol/L H2SO4 99.5ml
将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。
2、操作方法
2.1、制备接种菌液：临床标本中分离的细菌做药敏试验，应挑取已分纯的菌落4～5个制备菌悬液。
制备菌液的方法是挑选琼脂平板上、形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中，置35℃水箱中孵育4小时，校正浊度，或用接种环挑取菌落，悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。此法制备接种菌液适用于任何细菌。
2.2、接种平板：制备好的接种菌液必须在 15min内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液；在管壁上旋转挤
压几次，去掉过多的菌液。
用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将乎板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。
2.3、贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为 90mm的平板最好贴6张。
贴上纸片后，须在15min内放35℃孵箱培养。不可放在CO2环境中。
2.4、孵育：必须用35℃孵箱，平板在孵箱内最好单独摆放，不超过二个叠在一起，否则中间的平板，达不到孵箱温度而产生预扩散的作用，平板孵育18～24h后，读取结果。
2.5、判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。按抑菌环直径判断细菌的敏感性。
