第２９卷第５期 热带作物学报 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＣＲＯＰＳ Ｖｏｌ＿２９ Ｎｏ．５ ０ｃｔ．２００８ ２００８年１０月 甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列 的克隆、分析及数目研究 屈满义 查向东 王 钰 ， 杨金环 ， 蒋 琳 ， 阮 龙。 学学院 ． ２３００３９ １安徽大学一生命科２安徽省生态工程与生物技术重点实验室 合肥３安 徽 省 农 业 科 学 院 合肥２３００３１ 摘 要 根据植物抗病基因保守序列设计特异引物，对甘薯高抗茎线虫病品种ＡＢ９４０７８—１、感病品种徐１８及其 ８个后代品系进行ＰＣＲ扩增。获得１５个具有完整氨基酸读码框的片段，均具有ＮＢＳ类抗病蛋白４个保守基序， 其中５个片段含ＬＲＲ结构。利用从亲本ＡＢ９４０７８—１扩增的Ｒ５ｌ０一ＡＢ作为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果表明， 其在基因组中存在多个拷贝，并估计其在基因组中的拷贝数目，克隆新的甘薯ＲＧＡ序列，为进一步获得甘薯抗 病基因打下基础。 关键词 甘薯 抗病基因同源序列 ＮＢＳ—ＬＲＲ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 中图分类号Ｑ９４３．２ 植物在与病原物相互作用的长期进化过程中，逐渐产生了抗病基因（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ，Ｒ ｇｅｎｅｓ）系统， 使植物对病毒、细菌以及线虫等病原物的侵染表现出一定的防御反应＿】１，克隆Ｒ基因对深入了解植物抗病 机理及进行分子育种进而改良种质资源具有重要意义。甘薯种植广泛，是重要的粮食作物及工业原料， 其主要病害有线虫病、黑斑病和根腐病等，发病后甘薯一般减产３０％～４０％，重者７０％以上甚至绝收圈。 甘薯基因组较大，尚未获得高密度图谱，通过图位克隆等方法克隆抗病基因仍具有一定困难。依据抗病基 因保守结构域设计引物进行ＰＣＲ扩增获得的序列称为抗病基因同源序￣（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｏｇ，ＲＧＡ）ｔ３１。 研究显示ＲＧＡ大多是抗病基因的一部分，或与抗病基因连锁 ，或者就是潜在的抗病基因＿引。所以通过获 得ＲＧＡ进而克隆全长抗病基因将是一条快捷途径。核苷酸结合位点一富含亮氨酸重复（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｌｅｕｃｉｎｅ—ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ，ＮＢＳ—ＬＲＲ）类抗病基因是Ｒ基因中最大的类群，其蛋白产物含一个ＮＢＳ和一个 ＬＲＲ结构域［６１，ＮＢＳ结构域具有４个高度保守的基序，目前主要依据这些基序来设计引物，进行ＰＣＲ扩增 并克隆ＲＧＡ。林巧玲等同依据ＮＢＳ结构域设计简并引物对徐薯ｌ８进行ＲＧＡ分离，共获得２０个甘薯ＮＢＳ— ＬＲＲ类抗病基因类似序列，且可分为具有Ｔｏｌｌ蛋白白介素一１受体（Ｔｏｌｌ—ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｏｍａｉｎ， ＴＩＲ）结构和不含Ｔｏｌｌ蛋白白介素一１受体（ｎｏｎ－ＴＩＲ）结构的两类ＮＢＳ—ＬＲＲ序列。Ｃｈｅｎ等阎以甘薯青农２号为 材料克隆ＲＧＡ，并进行了ＲＧＡ的多样性及进化关系分析。本研究对甘薯亲本及其Ｆ 群体进行ＲＧＡ分离， 获得了新的甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列，并对其在基因组中拷贝数目进行了初步分析，为进一步 克隆甘薯Ｒ基因奠定基础。 １材料与方法 １．１植物材料及生化试剂 选用甘薯高抗茎线虫品种ＡＢ９４０７８—１、高感品种徐薯１８及两者杂交后代品系８个，编号为１６、ｌ７、 ３４、３７、７９、８３、１０７、１６９，后代品系经连续２年进行田间抗病鉴定，其中１６、１７、３７、１０７、８３为抗 安徽省自然科学基金项目（编号：０５０４１０１０４），安徽省高校省级自然科学研究重点项目（编号：ＫＪ２００７Ａ０９１），安徽大学分子药理学创新团队 项目（编号：０２２０３１０９）资助。 屈满义男，１９８３年生，硕士研究生。研究方向：植物分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｍａｎｙｉ８３ｌＯ＠ｙａｈｏｏ．ＯＯｌｌｌ １。 通讯作者查向东，Ｅｍａｉｈ ｘｄｃｈａ＠１６３．ｃｏｒｎ； 通讯作者王钰，Ｅｍａｉｈ ｙｕｗａｎｇ８００＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ。 收稿日期：２００８—０ｌ—Ｏ７ 修回日期：２００８—０５—２６ ５期 屈满义等：甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究 ６１１ 病品系，３４、７９、１６９为感病品系，试验材料由徐州农科所甘薯研究中心、安徽省农业科学院提供。大肠 杆菌ＤＨ５ａ菌株由本实验室保存；质粒载体ｐＭＤ１８一Ｔ、性内切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶等购自ＴａＫａＲａ公 司；琼脂糖凝胶ＤＮＡ纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京道普生物公司；琼脂糖购自ＯＸＯＩＤ公 司；Ｄｉｇ Ｒａｎｄｏｍ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ购自博士德公司。 １．２甘薯总ＤＮＡ的提取 甘薯基因组ＤＮＡ提取采用改进的ＣＴＡＢ法 。 １．３ 引物设计与ＰＣＲ扩增 根据Ｈｅ等克隆的甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＤＱ９０３６４０）的Ｐ—ＬＯＯＰ和 ＧＬＰＬＡ区序列设计上游引物Ｐ一１：ＣＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡ，下游引物Ｐ一２：ＣＣＡＣＧＣＴＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＣ１Ｔｒ， 引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以基因组ＤＮＡ为模板，利用上述引物进行ＰＣＲ扩增， 反应体积为２Ｏ Ｌ，其中包含Ｉ￣ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２，ｄＮＴＰ ０．４ ｍｍｏ￣Ｌ，上、下游引物各３ ｍｍｏｌ／Ｌ， 模板ＤＮＡ ３０￣５０ ｎｇ，１．５ Ｕ Ｔａｑ酶，反应在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５３３１型ＰＣＲ仪上进行。扩增程序为：９４℃２ ｍｉｎ； ９４℃４０ Ｓ，５５ ｏＣ ５０ Ｓ，７２℃９０ Ｓ，３０个循环；７２ ｏＣ ５ ｍｉｎ；４℃保存。扩增产物在１％琼脂糖凝胶中电 泳９０ ｒａｉｎ后在凝胶成像系统上观察并拍照保存。 １．４ 目的片段的回收及克隆 目的片段的回收按试剂盒使用说明进行。回收的ＤＮＡ片段连接到ｐＭＤ１８一Ｔ载体上。连接产物转化 感受态大肠杆菌ＤＨ５ａ菌株。选取经ＰＣＲ鉴定后的阳性克隆按试剂盒使用说明抽提质粒ＤＮＡ。 １．５序列测定及分析 将含插入目的片段质粒送上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物技术公司测序。利用ＮＣＢＩ站点上的ＢＬＡＳＴ工具对测序 结果进行相似性比较，利用ＤＮＡｓｓｉｓｔ ｖｅｒｓｉｏｎ１．０软件进行氨基酸序列的推导，利用Ｃｌｕｓｔａｌ软件进行多序 列比较，使用ＭＥＧＡ３软件中邻接法（ｎｅｉｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ＮＪ）进行统计分析获得聚类分析图。 １．６ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 用性内切酶 ０Ｒ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｈｉｎｄｍ及ｓｏ／Ｉ完全消化ｌ２ ｇ基因组ＤＮＡ（３７ ｏＣ ４ ｈ），０．８％琼 脂糖凝胶电泳３ ｈ（５Ｖ・ｃｍ ），使酶切产物充分分开。转膜、标记探针、杂交、洗膜及显色均按Ｄｉｇ Ｒａｎｄｏｍ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ使用说明进行。取浓度已知的、以ＡＢ９４０７８—１为模板扩增获得的约 ５１０ ｂｐ ＤＮＡ片段纯化产物，分别稀释ｌ０倍、２０倍、３０倍、５Ｏ倍、１００倍，取稀释后产物各１ Ｌ作标准 对照，与经内切酶ＨｉｎｄｌｌＩ、ＥｃｏＲ Ｉ完全消化的基因组ＤＮＡ同时上样进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（６５℃１８ｈ）。利用 Ｂａｎｄｓｃａｎ软件扫描对比杂交条带的强度，参考Ｂ．Ｒ．格利克等 叫基因拷贝数的测定方法并使用校正公式： ｘＸ ＝ｚ，计算甘薯单倍体基因组中待测ＲＧＡ的拷贝数目。公式中 ：单倍体基因组中待测片段拷贝 ＯＯＵＸ 数；Ｇ：同源六倍体甘薯的单倍体基因组大小（ｂｐ），取８．０４ｘ１０ ｂｐ［“ ；Ｃ：阿伏加德罗常数，６．０２ｘ１０ ； Ｙ：基因组ＤＮＡ上样量（ｇ）；Ｚ：样品中待测片段的总拷贝数（根据对比杂交强度估算）；６６０ｘＧ为甘薯基 因组的分子量， 表示Ｙｇ的样品中含有甘薯基因 组的拷贝数，求得 即可。 ２结果与分析 １００ ２．１甘薯抗病基因同源序列的ＰＣＲ扩增、克隆与测序 １０ 以ＡＢ９４０７８—１、徐薯１８及两者杂交８个后代品系的 基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增结果显示，１０个被测样 品均获得１条１ １００ ｂｐ左右强带和１条５１０ ｂｐ左右弱带 （图１）。退火温度升至６１℃时仅出现１ １００ｂｐ扩增条带， Ｍ．１００ ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ；１．ＡＢ９４０７８—１；２．徐薯１８； ３—１Ｏ分别为：１６，１７，３４，３７，７９，８３，１０７，１６９。 表明１ １００ｂｐ序列与引物结合的特异性较５１０ｂｐ强。 图１ ＡＢ９４０７８—１、徐薯１８及８个后代品系ＰＣＲ产物 ６１２ 热带作物学报 ２９卷 将ＰＣＲ产物回收纯化，挑取阳性克隆进行测序。片段大小不同的测序结果归为两组：Ｒ１１００组和 Ｒ５ｌ０组，具体序列依据品系来源不同命名为ＲＩ１００一ＡＢ、Ｒ５１０一ＡＢ、Ｒ１１００—１６、Ｒ５１０－１６，依此类推。 测序结果显示，Ｒ５１０组的ｌ０个序列长度为５１０－５３９ ｂｐ，均能推导出完整的氨基酸序列。Ｒ１１００组的１０ 个序列长度为１ １００～１ １４８ ｂｐ，为上游引物Ｐ一１单引物扩增产物，即该１０个序列５ 、３ 端存在１８ ｂｐ的反 向重复结构。 ２．２甘薯抗病基因同源序列相似性比较与分析 将得到的２６个序列片段利用ＢＬＡＳＴ进行在线同源性检索，结果显示，２６个序列均与ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗 病基因或同源序列有较高的相似性。利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ软件对１５个能推导出氨基酸序列的ＲＧＡ与烟草抗烟 草花叶病毒（Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ＶＪＥｌｌＳ，ＴＭＶ）基因Ｎ、西红柿抗根结线虫病基因Ｍｉ一１．１及Ｍｉ一１．２的编码蛋白 进行多序列比对（图２）。由图２可知，Ｒ５１０组与Ｒ１１００组为的两组片段，即使来源于同一品系的 ＲＧＡ，其序列差异性也较大。 Ｒ５１０组的１０个序列，编码１７０－１７４个氨基酸残基，１Ｏ条氨基酸序列均具有Ｐ—ＬＯＯＰ（ＧＧＶＧＫＴＴ）、 Ｋｉｎａｓｅ２（Ｒ／ＫａａａＶＬＤＤＶＷ／Ｄ）、Ｋｉｎａｓｅ３ａ（ＧＳＲａａａＴＴ／ＳＲ）、ＧＬＰＬＡ区等ＮＢＳ结构域的４个保守基序。其中， Ｒ５１０—１０７属于ＴＩＲ类ＮＢＳ抗病基因同源序列，其Ｋｉｎａｓｅ２结构域最后一位氨基酸为天冬氨酸；其他９个 片段属于ｎｏｎ—ＴＩＲ类ＮＢＳ—ＬＲＲ抗病基因同源序列，Ｋｉｎａｓｅ２结构域最后一位氨基酸为色氨酸＿１２１，与林巧玲 等 甘薯中存在２种ＮＢＳ—ＬＲＲ类序列的研究结果一致。总之，Ｒ５１０组的１０个ＲＧＡ与已报道的甘薯 ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ片段大小接近，而序列有差异。将该１０个片段提交至ＧｅｎＢａｎｋ，登录号为ＥＦ３７１４６９， ＥＦ４２９１９５，ＥＦ５２３３７１，ＥＦ５２３３７３，ＥＦ６４１ １ １４，ＥＦ６４１ １ １６，ＥＦ６４１ １ １８，ＥＦ６４１ １２０，ＥＦ６４１ １２２，ＥＦ６４１ １２４。 Ｒ１１００一ＡＢ、Ｒ１１００—１６、Ｒ１１００—３４、Ｒ１１００—７９、Ｒ１１００—１６９等５个片段能推导出部分完整的氨基酸 序列，序列中出现无义突变，终止密码子前序列长度为２３９～３３１个氨基酸残基。该５个片段均具有ＮＢＳ 结构域的４个保守基序，同时其Ｃ端氨基酸序列存在ＬＲＲ结构（图２），为ｎｏｎ—ＴＩＲ—ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ。 ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＦ４０８８０４，ＥＦ５２３３７４，ＥＦ６４１ １ １７，ＥＦ６４１ １２３，ＥＦ６４１ １２５。 Ｒ１１００组其余５个片段在线比对显示均与ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源性较高，但序列中出现无义突 变，不能推导出完整的氨基酸序列。ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＥＦ４２９１９６，ＥＦ５２３３７２，ＥＦ６４１１１５，ＥＦ６４１１１９， ＥＦ６４１１２１。 序列比对结果显示：保守基序以外的氨基酸序列也具有相似性（图２），但碱基序列中还是存在着很多 点突变、小片段插入和缺失。 利用ＭＥＧＡ３软件，将Ｒ５１０组的ｌ０个片段及Ｒ１１００一ＡＢ、Ｒ１１００—１６、Ｒ１１００—３４、Ｒ１１００—７９、 Ｒ１１００—１６９等１５个具有Ｒ基因ＮＢＳ保守结构域的ＲＧＡ与ＧｅｎＢａｎｋ数据库公布的甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ 进行聚类分析（图３）。 结果显示，已克隆的甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ聚为多个类群，其中Ｒ５１０一ＡＢ、Ｒ５１０—８３、Ｒ５１０—３４、 Ｒ５１０－１６、Ｒ５１０－３７、Ｒ５１０－Ｘ１８与Ｒ５１０－１７成为一新的类群，我们称之为Ｒ５１０类群。Ｒ１１００组聚为另一 新类群。Ｒ５１０类群中Ｒ５１０—８３、Ｒ５１Ｏ一３４、Ｒ５１０—１６、Ｒ５１０—３７及Ｒ５ｌ０—１７为来源于ＡＢ９４０７８—１、徐薯 １８杂交子代品系的ＲＧＡ，Ｒ５１０－８３与Ｒ５１０－ＡＢ构成一个９７％自展支持率的分支，其遗传距离为０， Ｒ５１０一ＡＢ与Ｒ５１０类群中其它ＲＧＡ遗传距离为０．００６～０．１８１；Ｒ１１００类群中来源于Ｆ 代的ＲＧＡ与Ｒｌ１００一ＡＢ 的遗传距离为０．０８２－０．１７５。图３中，Ｉ类群为来源于甘薯青农２号的ＲＧＡｔ８１，Ｉ１类群为来源于徐薯ｌ８的 ＲＧＡ［￣，１１类群为来源于甘薯Ｊｅｗｅｌ品种的ＲＧＡ。Ⅱ类群与Ｒ５１０类群、Ｒ１１００类群亲缘关系较近，可能因 为本研究所用材料中徐薯１８为亲本之一，此结果也表明ＲＧＡ也可能为植物种群分化或亲缘关系研究提 供一定的依据。 ２．３ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交 选取在Ｒ５１０－ＡＢ中无酶切位点的ＢａｍＨ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＨｉｎｄｌｌＩ及Ｓａｌ Ｉ，分别对甘薯ＡＢ９４０７８—１品种 屈满义等：甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究 ２ Ｄ ．－ｂ ４ ０ ６０ Ｒ５１Ｄ—ＡＢ ６３ Ｒ５１０—８３ ６３ Ｒ５１０—３４ ６３ Ｒ５１口一１６ ６３ Ｒ５ １Ｄ—Ｘ１８ ６３ Ｒ５１０—１７ ６３ Ｒ５１Ｄ一７ ９ ６３ Ｒ５１０—１６９ ６３ Ｒ５１０—３７ ６３ Ｒ５１０—１０７ ６９ Ｎ ６７ Ｍｉ一１．１ ６１ Ｍｉ一１．２ ６１ Ｒ１１００一ＡＢ ６０ Ｒ１１Ｄ口一１６ ６口 Ｒ１１Ｄ口一１６９ ６１ Ｒ１１０口一３４ ６Ｄ Ｒ１１０口一７９ ６１ Ｔ． 二丽 ８ ０ １０口 １２口 １ Ｒ５１０一ＡＢ １２ ４ Ｒ５１口一８３ １２４ Ｒ５１Ｄ一３４ １２ ｚｔ Ｒ５１口一１６ １２ ｚｉ Ｒ５ １Ｄ—Ｘ１８ １２４ Ｒ５１Ｄ一１７ １２４ Ｒ５１０—７９ １２ ｚｔ Ｒ５１０—１６９ １２７ Ｒ５１０—３７ １２４ Ｒ５ｌ０—１０７ ｌ３０ Ｎ １２６ Ｍｉ一１．１ １２２ Ｍｉ一１．２ １２２ Ｒ１１０ ０一ＡＢ １１８ Ｒ１１０ ０—１６ １１８ Ｒ１１０ ０—１６９ １１９ Ｒ１１０ Ｄ一３ ４ １１８ Ｒｌ１口０—７ ９ １２０ —Ⅱ ｜ｉｎ Ⅷ■ ４ ０ １６Ｄ １８ ０ ２Ｄ０ Ｒ５１Ｄ—ＡＢ ｌ７０ Ｒ５１口一８３ １７０ Ｒ５１Ｄ一３４ １７Ｄ Ｒ５１Ｄ一１６ １７０ Ｒ５１Ｄ—Ｘ１８ １７Ｄ Ｒ５１０—１７ １７０ Ｒ５１Ｄ一７ ９ １７０ Ｒ５１０—１６９ １７ ４ Ｒ５１０—３７ １７ ０ Ｒ５１Ｄ一１Ｄ７ １７３ Ｎ １９２ Ｍｉ—１．１ １８９ Ｍｉ—１．２ １８ ９ Ｒ１１ＤＤ—ＡＢ １８７ Ｒ１１０口一１６ １８７ Ｒ１１００—１６９ １８８ Ｒ１１０Ｄ一３４ １８７ Ｒ１１０ ０—７ ９ １８９ Ⅳ 面瓦Ａ ２２０ ２４ ０ ２６Ｏ Ｒ５１０一ＡＢ …………………＿＿＿……………………………………… Ｒ５１０—８３ …………………………………一＿＿＿…………………… Ｒ５１０—３４ ………一……………………………………………＿＿＿…一 Ｒ５１０—１６ …………………＿＿＿………………………一…………… Ｒ５１０一Ｘｌ８ …………………＿＿＿…………………………………＿＿＿… Ｒ５ｌ０—１７ ……………………………………＿＿＿………………＿＿＿… Ｒ５１０—７９ ……………………………………＿＿＿…………………… Ｒ５１０—１６９ …………………＿＿＿………………＿＿＿…………………… Ｒ５１０—３７ 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一～一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 Ｒ５１０—１０７ Ｎ ２６１ Ｍｉ一１．１ ２２０ Ｍｉ一１．２ ２２０ Ｒ１１００一ＡＢ ２２１ Ｒｌ１Ｄ０一ｌ６ ２２１ Ｒ１１０口一１６９ ２２２ Ｒ１１０口一３４ ２２１ Ｒ１ｌＤ０—７９ ２２３ Ｌ Ｌ 工Ｌ Ｌ Ｌ ６１３ ５期 ６１４ ２ ８０ Ｒ５１０一ＡＢ 热带作物学报 ３２０ ３４口 ２９卷 ３口０ Ｒ５１０—８３ Ｒ５１０—３４ Ｒ５１Ｄ一１６ Ｒ５１０一Ｘ１８ Ｒ５１口一１７ Ｒ５１口一７９ Ｒ５１口一１６９ Ｒ５１０—３７ Ｒ５１０—１０７ Ｎ ３３口 ２８９ ２８９ ２５２ Ｍｉ一１．１ Ｍｉ一１．２ Ｒｌ１００一ＡＢ Ｒｌ１口０一ｌ６ Ｒ１１口０—１６９ Ｒ１１口口一３ ４ ２３９ ２ ４Ｄ ２３ ９ Ｒ１１０口一７ ９ 工 Ｌ ２４ ４ ３６口 Ｒ５１０一ＡＢ ３８口 ４口口 Ｒ５１０—８３ Ｒ５ｌＤ一３ ４ Ｒ５１口一１６ Ｒ５１０一Ｘ１８ Ｒ５１０—１７ Ｒ５１口一７９ Ｒ５１口一１６９ Ｒ５１口一３７ Ｒ５１口一１口７ Ｎ ３９ ９ Ｍｉ一１．１ ３５７ ３５８ Ｍｉ一１．２ Ｒ１１口口一ＡＢ Ｒ１１０ ０—１６ Ｒ１１口口一ｌ６９ Ｒ１１口Ｄ一３ ４ Ｒ１１口口一７ ９ 工 Ｌ工 Ｌ 工 工Ｌ ＬＬ 工 Ｌ Ｌ Ｌ ３１７ ２９３ ２９１ ２９口 ２９２ ４２０ Ｒ５１０一ＡＢ Ｒ５１０—８３ Ｒ５１口一３４ Ｒ５１０—１６ ４４口 ４６口 ４８口 Ｒ５ １０一Ｘ１８ Ｒ５１口一ｌ７ Ｒ５１０—７９ Ｒ５１０一ｌ６９ Ｒ５１０—３７ Ｒ５１０—１Ｄ７ Ｎ ４６８ ４１４ Ｍｉ一１．１ Ｍｉ—１．２ Ｒ１ｌＤ０一ＡＢ Ｒ１１Ｄ口一１６ Ｒ１１０口一１６９ ４ｌ５ ３７口 ３３３ ３３１ Ｒ１ｌ０口一３４ Ｒ１１０口一７９ Ｌ 工Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ 工 Ｌ ３１８ ３２０ Ｖ．ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎ Ｉ～Ⅳ：ＮＢＳ结构域的４个保守基序；Ｖ：ＬＲＲ结构域；Ｎ：烟草抗ＴＭＶ蛋白；Ｍｉ—１．１，Ｍｉ一１．２：西红柿抗根结线虫病蛋白 Ｘ：终止密码子；ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎ：富含亮氨酸重复结构域。 图２ １５个ＲＧＡ的氨基酸序列与Ｎ、Ｍｉ一１．１、Ｍｉ一１＿２蛋白多序列比对结果 ５期 屈满义等：甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究 ６１５ Ⅱ Ⅲ ————————— ｌ ０ 图３甘薯１５个ＲＧＡ与ＮＢＣＩ站点上发表的甘薯ＲＧＡ聚类分析结果 基因组ＤＮＡ进行酶切，地高辛标记纯化的Ｒ５１０一ＡＢ序列作为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。 从图４可见，基因组经Ｓａ／Ｉ、Ｈｉｎｄｍ、 ＤＲ Ｉ及ＢａｍＨ １分别酶切后，各出现２、３、５、３条带，说 明Ｒ５１０类群序列在甘薯基因组中可能是具有散在成分的串联重复。以不同拷贝数的Ｒ５１０－ＡＢ作标准对 照上样进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，经计算，在甘薯单倍体基因组中Ｒ５１０类群的序列拷贝数约为１７０８，而该类群 ６１６ 热带作物学报 ２９卷 应该只是整个甘薯基因组ＮＢＳ—ＬＲＲ类序列的一部分，一 些非Ｒ５１０类群的相似序列也有可能与探针结合，但仍 可以推断甘薯基因组中包含的ＮＢＳ—ＬＲＲ类序列拷贝数 要高于这个数目。 ３ 讨论 ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因是Ｒ基因中最普遍的类群， 据统计，约有７５ 的抗病基因具有ＮＢＳ—ＬＲＲ结构＿ｌ引。本 研究根据已克隆的ＮＢＳ—ＬＲＲ类同源蛋白的Ｐ－ＬＯＯＰ、 ＧＬＰＬＡ两个基序设计引物对甘薯进行ＲＧＡｓ分离，丰富 了甘薯ＲＧＡ种类和数量，进一步证实甘薯中存在ＴＩＲ和 ｎｏ—ＴＩＲ两种结构的ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ。 本研究获得的Ｒ１１００组片段为单引物扩增结果， 其中５个片段的编码产物除包含ＮＢＳ ４个基序外还具 １～４：ＡＢ９４０７８—１分别经Ｓｏｌ Ｉ、Ｈｉｎｄ１１、ＥｃｏＲ Ｉ及ＢａｍＨ Ｉ酶切 图４甘薯Ｒ５１０一ＡＢ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果 Ｂｏｚｋｕｒｔ等［ ４１在扩增小麦ＲＧＡ时，也出现单个弓 有ＬＲＲ结构，这是首次报道甘薯ＲＧＡ的ＬＲＲ结构域。 物在正反两个方向与目的片段结合的现象，且目的序列编码产物含ＬＲＲ结构。以具有完整ＮＢＳ结构域的 ５ ２ ２ ｌ １ Ｒ５１０一ＡＢ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，并估算出Ｒ５１０类群在基因组中的拷贝数，进而推测ＮＢＳ类序列在 瑚 甘薯基因组中以多拷贝形式存在。Ｚｈｏｕ等＿１５１在对水稻抗病基因的研究中发现，ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因及同 源序列占整个基因组的１％～２％，而拟南芥具有１４９条ＮＢＳ—ＬＲＲ类序列，且这些序列在基因组中都是以 多拷贝成簇形式存在的 ６１。本研究中的ＲＧＡ是否同样成簇存在于甘薯基因组中尚需进一步研究。大量非 功能基因或假基因的成簇存在，一定程度上会增大Ｒ基因的进化空间ｌ１４１，甘薯作为主要的农作物，种植范 围广且种植历史较长，基因组中ＮＢＳ—ＬＲＲ类ＲＧＡ的多重复存在，保证其能够产生多种ＮＢＳ－ＬＲＲ类Ｒ 基因，以抵抗不同地域环境下病原体的侵染。 本研究选择对茎线虫病具有不同田间抗性表现的甘薯品系进行ＲＧＡ分离，均获得具有明显ＮＢＳ－ＬＲＲ 结构特征的ＲＧＡ，但尚不能依据ＲＧＡ的序列特征作为判定抗病性状的分子指标。结果表明，植物抗线虫 病基因组中普遍存在ＮＢＳ—ＬＲＲ结构，Ｍｉｌｌｉｇａｎ等 以图位克隆法克隆了西红柿抗根结线虫病基因Ｍｉ，其 编码蛋白由１ ２５７个氨基酸组成，含１个ＮＢＳ结构和１个ＬＲＲ结构。本研究得到的２０个甘薯ＲＧＡ中的 Ｒ５１０一ＡＢ、Ｒ５１０—８３、Ｒ５１０—３４等序列与抗线虫病基因Ｍｉ的序列同源性较高，均达到了６０％（图２），且 在某些特征性的区域几乎完全一致，提示这部分ＲＧＡ很有可能是抗线虫病相关序列，此结果有助于克隆 获得甘薯抗线虫病基因全长序列，并了解其序列中内含子及区等信息，从而揭示甘薯抗线虫病分子机 制，为植物分子育种提供重要参考。 致谢承蒙中国农业科学院作物科学研究所夏先春研究员对本文进行了精心修改，在此深表感谢。 参考文献 １ ＤｅＷｉｔ Ｐ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ａ ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２（１２）：４５２￣４５８ ２蒋 琳， 阮龙，查向东，等．一个与甘薯茎线虫病抗性相关的ＲＡＰＤ标记的获得【Ｊ］．分子植物育种，２００７，５（５）：６５５－６６０ ３ Ｌｏｐｅｚ Ｃ Ｅ，Ｚｕｌｕａｇａ Ａ Ｐ，Ｃｏｏｋｅ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｇｅｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ（ＲＧＣｓ）ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ＲＧＣ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ ｃａｓｓａｖａ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００３，２６９（５）：６５８－６７１ ４ Ｒａｄｗａｎ Ｏ，Ｂｏｕｚｉｄｉ Ｍ Ｆ，Ｎｉｃｏｌａｓ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＰＣＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＩ５／ＰＩ８ ｌｏｃｕｓ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｈａｌｓｔｅｄｉｉ ｉｎ ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｌＩ８ Ｌ．ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＣＣ—ＮＢＳ—ＬＲＲ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００４，１０９（１）：１７６－１８５ ５王彦华，候喜林， 申书兴，等．不结球白菜抗病基因同源序列的克隆及分析［Ｊｌ＿中国农业科学，２００６，３９（１２）：２６２１～２６２６ ６ Ｍｅｙｅｒｓ Ｂ Ｃ，Ｋｏｚｉｋ Ａ，Ｇｒｉｅｇｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＢＳ—ＬＲＲ—ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００３，１５（４）： ８０９￣８３４ ５期 屈满义等：甘薯ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列的克隆、分析及数目研究 ６１７ ７林巧玲，罗会才．甘薯中ＮＢＳ—ＬＲＲ类抗病基因同源序列的克隆及序列分析ｆＪ１．西北农业学报，２００７，ｌ６（２）：６５～６９ ８ Ｃｈｅｎ Ｇ Ｓ，Ｐａｎ Ｄ Ｒ，Ｚｈｏｎ Ｙ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ—ｅｎｃｏｎｄｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｌａｍ．）［ＪＩ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ，２００７，３２（４）：７１３－７２１ ９ Ａｌｌｅ ｎ Ｇ Ｃ，Ｆｌｏｒｅｓ—Ｖｅｒｇａｒａ Ｍ Ａ，Ｋｒａｓｙｎａｎｓｋｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａ ｍｏｄｉｉｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｆ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｅｔｙｈｒｉｍ－ ｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１（５）：２３２０￣２３２５ １０ Ｂ．Ｒ．格利克，Ｊ．Ｅ．汤普森．植物分子生物学及生物技术的实用方法［Ｍ］．李汝刚，张春义译．重庆：重庆出版社，１９９９．３４－３６ １ １ Ｓａｒａｎｙａ Ｓｆｉｓｕｗａｎ，Ｄａｒａｓｉｎｈ Ｓｉｈａｃｈａｋｒ，Ｓｏｎｊａ Ｓｉ ａｋ—Ｙａｋｏｖｌｅｖ．Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ （ ｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｌａｍ．） ａｎｄ ｉｔｓ ｗｉｌｄ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ ｔｈｒｏｔＩｓｈ ｔｈｅ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００６．１７１（３）：４２４～４３３ １２ Ｍｅｙｅｒｓ Ｂ Ｃ，Ｄｉｅｋｅｒｍａｎ Ａ Ｗ，Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ Ｒ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａｎ ａｎｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ—ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，２Ｏ（３）：３ １７－３３２ １３ Ｘｕ Ｑ，Ｗｅｎ Ｘ Ｐ，Ｄｅｎｇ Ｘ Ｘ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＲ ａｎｄ ｎｏｎ ＴＩＲ ＮＢＳ—ＬＲＲ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｕｓ ｉｎ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｒｏｓｅ（Ｒｏｓａ ｒｏｘｂｕｒｇｈｉｉ Ｔｒａｔｔ）［Ｊ１＿Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，１ １ １（５）： ８１９～８３０ １４ Ｂｏｚｋｕｒｔ ０，Ｈａｋｋｉ Ｅ Ｅ，Ａｋｋａｙａ Ｍ Ｓ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ＮＢＳ—ＬＲＲ ｔｙｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｕｓｉｎｇ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，４５（５／６）：４６９～４８６ １ ５ Ｚｈｏｕ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｊ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＢＳ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｎｏｎ—ＴＩＲ ＮＢＳ—ＬＲＲ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４，２７１（４）：４０２－４１５ １６涂礼莉，张献龙，朱龙付，等．海岛棉抗病基因类似物的起源、多样性及进化叨．遗传学报，２００３，３０（１１）：１０７１－１０７７ １７ Ｍｉｌｌｉｇａｎ Ｓ Ｂ，Ｂｏｄｅａｕ Ｊ，Ｙａｇｈｏｏｂｉ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｍｉ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｌｅｕｃｉｎｅ－Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｐｌｎｔａ Ｃｅｌｌ，１９９８，８（１ ｏ）：１３０７～１３１９ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ａｓｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ＮＢＳ—ＬＲＲ Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｏｇｓ ｆｒｏｍ Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｑｕ Ｍａｎｙｉ Ｚｈａ Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ ＿ Ｗａｎｇ Ｙｕ ’ Ｙａｎｇ Ｊｉｎｈｕａｎ ＇ Ｊｉａｎｇ Ｌｉｎｇ ， Ｒｕａｎ Ｌｏｎｇ３ １ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３９ ２ Ａｎｈｕｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｅｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３９ ３ Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３ １ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＮＢＳ——ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓ－ ｔａｎｅｅ ｇｅｎｅｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ），ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ ＡＢ９４０７８—１，Ｘｕｓｈｕ ｌ ８ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ８ ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ．Ｆｉｔｅｅｎ ｒｅｓｆｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ（ＲＧＡ）ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎ ４ ｍｏｔｉｆｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮＢＳ ｄｏｍａｉｎ，ａｎｄ ５ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｏｇｓ ａｌｓｏ ｐｏｓｓｅｓｓ ＬＲＲ ｄｏｍａｉｎ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｕｓｉｎｇ Ｒ５ １０－ＡＢ ａｓ ｐｒｏｂｅ，ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｍｕｈｉ— ｃｏｐｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ＡＢ９４０７８—１．Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＢＳ—ＬＲＲ ｂａｓｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓ— ｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｍｚｏｅａ ｂａｔａｔａｓ ｇｅｎｏｍｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ａｂｏｕｔ ｔｈｅｓｅ ＲＧＡｓ ｃａｎ ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａ ｇｅｎｏｍｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｌｏｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｎａｌｏｇ ＮＢＳ—ＬＲＲ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
