基础研究
血清中lncRNA-PVT1的检测方法建立及在肝癌诊断中的应用
朱怡卿
中国人民第二军医大学医学遗传学教研室 上海市 200084
【摘 要】目的：建立在血清中检测长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) PVt1的方法，并探讨该检测在肝癌诊断中的应用价值。方法：收集肝癌患者血清样本50例，正常志愿者血清样本40例，10对肝癌及癌旁组织样本。分别通过TRIzol和TRIzo LS提取组织和血清中的RNA，通过real-time PCR检测组织和血清中lncRNA-PVT1的相对含量。结果：lncRNA-PVT1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.01），lncRNA-PVT1在肝癌患者的血清中的表达显著高于正常患者。结论：成功建立了在血清中检测lncRNA-PVT1的方法，血清中lncRNA-PVT1的表达可以作为肝癌诊断的生物标志。
【关键词】血清；检测；肝癌
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一。据报道，全球每年有超过60万肝癌患者去世[1]。尽管外科治疗技术及放、化疗技术的进步极大地改善了肝癌患者的预后，但是当前针对肝癌的有效的治疗手段依然十分有限，肝癌患者，特别是晚期肝癌患者的术后生存率依然不乐观[2]。早期诊断和靶向治疗是肿瘤治疗的新方向，因此，发掘与肝癌发生密切相关的分子标志对肝癌的治疗具有重要的意义。
长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 是指长度超过200bp的一类非编码RNA分子[3]。随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究表明，lncRNA在物种间的表达具有较高的保守性和时空特异性，可通过吸附内源性的miRNA，结合蛋白质等方式广泛的参与生命活动
[4]
1 样本与实验方法
1.1 临床样本
临床样本取自2016年至2017年期间在第二军医大学第三附属医院东方肝胆医院就诊的肝癌患者及正常志愿者，在纳入排除标准下共收集到10 对肝癌及癌旁组织， 50例肝癌患者血清及40 例正常健康志愿者血清。1.2 RNA提取
采用 TRIzol LS 试剂( 美国 Invitrogen 公司) 提取 血清中的 RNA。按照说明书提取，最终冻存于 -80℃。采用 TRIzol 试剂( 美国 Invitrogen 公司) 提取组织中的 RNA。根据试剂说明书进行提取，最终用35µL无酶水溶解RNA，冻存于 -80℃。1.3 real-time PCR 检测
采
用PrimeScriptTM RT Reagent Kit
图1：5对引物在肝癌患者和正常志愿者
血清中的检测结果物 5'ACAGAGTCCGTTCAGTGTCAGA-3'，P3
下
游
引
物 5'ATT-GGGCTGG-
GTCTACACAAGT-3'; P4 上游引物 5'TGC-TTCGTGCTGATTCCTAGAC-3'，P4
下
游
引
物 5'TTGC-
TCTGTGCTGCCAGTTAG-3'; P5 上游引物 5'GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，P5
下
游
引
物 5'ACAC-
。同时，大量研究表明lncRNA表达的
紊乱与多种疾病的发生发展密切相关。目前，已有研究表明lncRNA-PVT1在肝癌组织中特异性高表达，并可通过NOP2蛋白的稳定性、特异性吸附miRNA参与肝癌的发生发展，是肝癌早期诊断和靶向治疗的潜在生物标志。然而，血清中检测lncRNA-PVT1的检测方法，及其在肝癌诊断中的意义仍无报道。因此，本研究拟从肝癌中特异性高表达的原癌基因lncRNA-PVT1入手，建立在血清中检测lncRNA-PVT1的方法，评价血清中lncRNA-PVT1表达检测对肝癌诊断的意义。
with gDNA Eraser 试剂( 大连 TaKaRa 公司) 对总 RNA 进行逆转录。采用 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 试剂( 大连TaKaRa 公司) 对合成的 cDNA 进行扩增，反应体系为 10 µL。lncRNA-PVT1 的5 对不同区段的引物如下: P1 上游引 物 5'-CGCTTCGCAGTGGAATGGAA-3'，P1
下
游
引
物 5'-CC-GTGGCA-上
AAAGTGCATACCTACCCA-3'。GAPDH
的
引
物
如
下:上
游
5'-TGAAGGTCGGAGTCAACG GATT-3'，下 游 5'-CTCGCTCCTGGAAGATG GTGAT-3'。1.4 统计学方法
采用Mann-Whitney 分析比较lncRNA-PVT1在肝癌患者血清、志愿者血清中的表达差异，采用配对 t 检验比较lncRNA-PVT1在肝癌、癌旁组织中表达的差异。使用GraphPad Prism 6.0 ( Graphpad Software
TTTCTGGTCTTGT-3'; P2 游
引
物 5'AAGACGGGCA-
CTCACAGACA-3'，P2 下游引物 5'AGC-GTTCTCTGGGCGTTCAT-3'; P3 上 游 引
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Inc，Caligornia) 软件进行所有统计学分析。
2 结果
2.1 lncRNA-PVT1片段在血清中表达的检测
考虑到lncRNA-PVT1长度为1957bp，在外周血中多以片段的形式存在，所以我们针对lncRN-PVT1的不同区域设计了5对检测引物进行检测。分别采用这5对引物，通过实时定量PCR的方法检测5例肝癌患者和5例正常志愿者血清中lncRNA-PVT1的表达。实验结果发现引物1，4，5均能在血清中检测到lncRNA-PVT1表达， 而引物2，3未能检测到lncRNA-PVT1的表达( 图 1) 。进一步的统计学分析显示，引物5检测到的正常志愿者和肝癌患者血清中的lncRNA-PVT1具有显著的统计学差异（P<0.01），所以，我们选择引物5进行后续研究。
2.2 lncRNA-PVT1片段在肝癌患者血清中高表达
为了明确引物5在组织及血清中检测lncRNA-PVT1表达的有效性，我们收集了10 对肝癌及癌旁组织样本，以及 50 例肝癌患者血清和40 例正常志愿者血清样本。结果显示， 10 例组织样本中， 8 例肝癌组织中lncRNA-PVT1呈显著高表达( P<0.05， 图2A) ，且肝癌患者血清中lncRNA-PVT1的表达显著高于正常志愿者( P<0.01，图 2B) 。提示血清中lncRNA-PVT1的表达值可能用于检测结肠癌。
A lncRNA-PVT1在10对癌和癌旁组织中的表达情况；B lncRNA-PVT1在正常志愿者和肝
癌患者血清中的表达情况
图2主要是由于lncRNA的长度较长，在血液中不稳定且易断裂，而主要以片段的形式存在于外周血中。Wang 等的研究采用多对引物对 lncRNA进行扩增 后，发现 lncRNA 的部分片段确实呈高表达且稳定地存在于外周血中。因此，本研究设计了 5 对针对 lncRNA-PVT1 不同区段的引物，结果发现引物5的扩增效果最为明显，而 引物2和引物3 都未能检测出lncRNA-PVT1在血清中的表达，该研究结果表明，在血清中lncRNA-PVT1缺失可能以片段形式存在。 采用 引物5 检测lncRNA-PVT1在组织中的表达，发现大部分组织中lncRNA-PVT1呈高表达。进一步采用较大样本检测发现lncRNA-PVT1在结肠癌患者血清中的表达显著高于正常志愿者，提示血清中
参考文献
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Hepatocellular carcinoma in non-alcoholic fatty liver disease: an emerging menace[J]. Journal of hepatology,2012,56(06):1384-1391.[2]Hlady R A, Robertson K D. A three-pronged epigenetic approach to the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.[3]Mathieu E L, Belhocine M, Dao L
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[4]Wu Z, Liu X, Liu L, et
al. Regulation of lncRNA expression[J]. Cellular & molecular biology letters,2014,19(04):561.
3 讨论
近年来，大量研究显示lncRNA在肿瘤的发生发展中具有重要的作用，是潜在的肿瘤早期诊断标志物及肿瘤靶向治疗靶点。其中，lncRNA-PVT1是一种广泛报道的癌胚分子，其表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。但少有文献报道lncRNA-PVT1在肿瘤患者血清中的表达。有研究提示，外周血中难以检测到lncRNA
lncRNA-PVT1的高表达可能是诊断肝癌的潜在生物标志。
综上所述，本研究建立了稳定的在血清中检测lncRNA-PVT1表达的方法，检测结果表明肝癌患者血清中lncRNA-PVT1的表达显著高于正常志愿者，提示血清中lncRNA-PVT1的表达值可能作为生物标志诊断肝癌。
作者简介
朱怡卿（1990-），江苏省盐城市人。硕士研究生。助教。研究方向为肿瘤，表观遗传。
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