垦 ・礁 杂走２０１２年２月舅３ 第３期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．３ 论 著・ 单管多重ＰＣＲ结合ＲＤＢ技术在 一地贫产前诊断中的应用 肖奇志，周玉球△，张永良，谢建红，郑 勤 （珠海市妇幼保健院检验科／珠海市医学遗传研究所摘要：目的５１９００１） 基因诊断结果在ａ地贫的产前诊断中具有决定意义。采取两种不同技术原理的方法验证产前诊断结果，是保 证产前诊断结果可靠性的基本要求。本文探讨检测常见非缺失型ａ一地贫的ＲＤＢ技术作为单管多重ＰＣＲ技术产前诊断ａ一地贫验 证方法的可行性。方法 采用双盲法，对７３例 一地贫产前诊断的标本分别采用针对中国人３种常见缺失型ａ地贫突变的单管多 重ｇａｐ—ＰＣＲ技术和针对常见３种非缺失ａ～地贫点突变的ＲＤＢ法进行分析，根据单管多重ＰＣＲ技术扩增产物电泳图谱和ＲＤＢ膜 条上显色的斑点分别判断某一个标本缺失型和非缺失Ⅱ地贫的突变类型，且与引产或出生后胎儿脐带血中Ｈｂ Ｂａｒｔ ｓ定量结果 进行比对。结果单管多重ＰＣＲ和ＲＤＢ技术均能分别准确检出常见缺失型和非缺失型ａ一地贫各种突变类型。如将两者结合分 析，还能提供相互佐证的重要信息：对于一一 、一ａ 和一“ 。自身或相互组合的各种基因型标本，其ＲＤＢ膜条的杂交斑点均不 显色；而一一 与ａ ｏｓａ和 组合的基因型标本该突变的正常对照点不显色。 地贫产前诊断结果与胎儿脐带血电泳结 果完全吻合。结论 单管多重ＰＣＲ结合ＲＤＢ技术同时应用于ａ一地贫的基因诊断，可保证产前诊断的可靠性，值得在临床遗传诊 断实验室中推广应用。 关键词：地中海贫血； 酶联免疫吸附测定； 产前诊断； 反向点杂交 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ ４ｌ ３０．２Ｏ１２．０３．００８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３—４１３０（２０ｌ２）０３—０２７ｌ－０３ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ Ｘｉａｏ Ｑｉｚｈｉ，Ｚｈｏｕ Ｙｕｑｉｕ ，Ｚｈａｎｇ Ｙｏｎｇｌｉａｎｇ，Ｘｉｅ Ｊ ｉｎｇｈｏｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｑｉｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｄ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＆Ｚｈｕｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｚｈｕｈａｉ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｍａｔｅｒｎｉｔｙ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｚｈｕｈａｉ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１９００１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ（ＲＤＢ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｎｏｎ ｄｅｌｅ— ｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａ ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ（ｃ｛－Ｔｈａｉ），ｉｎ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ（ＳＴＭＰ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａ—Ｔｈａ１．Ｍｅｔｈ－ ｏｄｓ ７３ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｏｆ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ ｄ Ｔｈａｌ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｂｙ ＳＴＭＰ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｏｎ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄ— Ｔｈａｌ（一一。ＥＡ，一ｃｔ４． ａｎｄ一 ）ａｎｄ ｂｙ ＲＤＢ ｆｏｒ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｏｎ ｎｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ｏｆ ｎ—Ｔｈａｌ（ＣｔＣＳ“，０ｔＱＳ旺ａｎｄ ｏｔｗＳⅡ）ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｂｌｉｎｄ ｔｒｉａ１．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆⅡ一ｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ＳＴＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａ Ｔｈａｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｓｐｏｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ＲＤＢ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｉｐ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｎｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ￣－Ｔｈａ１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎ— ｆｉｒｍｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｈｂ Ｂａｒｔ ｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｆｅｔｕｓ，ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｂｏｒｔｉｏｎ ｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＳＴＭＰ ａｎｄ ＲＤＢ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ｄ—Ｔｈａｉ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｂｉ— ｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ＳＴＭＰ ａｎｄ ＲＤＢ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｒｏｂｏｒａｔｉｖｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ：ｆｏｒ ｃｏｉｎ— ｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｙｐｅ ａ—Ｔｈａｉ ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ ｏｒ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ，ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｐｏｔｓ ｏｎ ＲＤＢ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｔｒｉｐ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｎｏ ｃｏｌｏｒ，ｂｕｔ ｆｏｒ一 。ＥＡ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ（、ｓ ａ ａｎｄ ｄＱ ａｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＷＳ ，ｗｅｒｅ ｃｏｌｏｒｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｔ ｏｆ ｎｏｎ—ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ．Ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｈｂ Ｂａｒｔ ｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｍａｔｃｈｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＭＰ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＤＢ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａ—Ｔｈａｌ ｃｏｕｌｄ ｇｕａｒａｎｔｅｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｏｒｔｈｙ ｏｆ ｄｅｐｌｏｙｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｐｏｐｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ； ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ； ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ ａ地中海贫血（ 地贫）是一组由于 珠蛋白基因的缺失 用两种不同技术原理的方法相互验证检测结果，以保证产前诊 或功能障碍导致ａ珠蛋白链完全缺如或合成不足所引起的遗 断的可靠性 ］。然而，由于临床遗传诊断实验室受到实验条 传性血液病，该病高发于中国南方各省区，尤以广东和广西两 件、技术水平和经济因素等影响，许多实验室客观上难以满足 省（区）为甚［１］。ｎ一地贫主要是因ａ一珠蛋白基因大片段的缺失 上述要求，故存在较大的技术风险。笔者在采用反向点杂交 为主（缺失型，如一一 、一ａ 、一 。 ），少数类型以碱基替代 （ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ，ＲＤＢ）检测非缺失型Ｑ一地贫过程中，发现该技 或几个核苷酸的缺失或插入（非缺失型，如ａ 、Ｇ｛ＱＳ和Ｃ｛ｗＳ）Ｉ 。 术既可准确检出常见非缺失型ｎ一地贫突变类型，还可以验证单 ａ一地贫最大的危害是严重影响生命质量的ＨｂＨ病和致死性 管多重ＰＣＲ（ｓｉｎｇｌｅ—ｔｕｂｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ，ＳＴＭＰ））检测严重类 Ｈｂ Ｂａｒｔ ｓ水肿胎。对严重类型ａ一地贫目前尚无根本有效的治 型ａ一地贫基因型的可靠性，在目前条件下不失为临床一种有效 疗方法，通过遗传筛查、遗传咨询和产前诊断选择性淘汰重症 的替代方法，现报告如下。 ａ一地贫胎儿是现实条件下惟一可行的手段。 １资料与方法 在地贫产前诊断的临床实践中，产前诊断技术规范要求应 １．１一般资料收集２００８～２０１０年在珠海市妇幼保健院进 ＊ 基金项目：广东省科技计划项目（２００９Ａ０３０３０１００２）、广东省自然科学基金（０４１０１６９１）。 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｚｈｏｕｙｑ＠１２６．ｃｏｒｎ。 ・ ２７２ ・ 国际检验医学杂志２０１２年２月第３３卷第３期ｌｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．３ 行地贫产前诊断的孕妇的羊水或脐带血，脐带血采用乙二胺四 前，必须设计一对引物特异扩增“。一珠蛋白基因片段。但部分 标本会出现无ａ 一基因特异扩增带的现象。为了防止ＰＣＲ扩 增失败的情况发生，确证ＰＣＲ扩增体系运行正常，遇到此情 乙酸三钾（ＥＤＴＡ Ｋ。）抗凝。７３例病例中年龄最大的４１岁，最 小的２Ｏ岁，中位数为２８岁；其中羊水５８例，脐带血１５例。孕 期从孕１ ７周加３天至３Ｏ周加２天。上述标本均采用经典的 况，需再取２支扩增管重新操作。一管加原始ＤＮＡ标本，另 一酚一氯仿法抽提人类白细胞基因组ＤＮＡ，ＴＥ溶解，采用紫外分 光仪测定其质量与浓度，以保证所抽提的ＤＮＡ质量符合要 求，在使用时稀释至２０ ｇ／ Ｉ 。严格按照产前诊断的要求进 行的平行试验。引产后或出生后留取的脐带血也采用 ＥＤＴＡ—Ｋ３抗凝。 管则加１／２的原始ＤＮＡ标本和１／２的正常ＤＮＡ标本再进 行ＰＣＲ扩增，若第一管仍然无特异扩增产物，而另一扩增管则 有特异扩增产物出现，说明ＰＣＲ扩增体系运转正常，无特异性 的扩增带则是ＤＮＡ标本本身基因缺失所导致。 １．４产后追踪或随访 对实施ａ一地贫产前诊断而引产或生下 的胎儿，要求留下ＥＤＴＡ—Ｋ。抗凝的脐带血用于血红蛋白电泳 和Ｂａｒｔ Ｓ水平定量或随访，以确认产前诊断结果的可靠性【 。 脐带血红蛋白电泳和Ｂａｒｔ ｓ定量采用ＳＰＩＦＥ快速自动电泳分 析系统（美国Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司）。 ２结 果 １．２常见缺失型 一地贫突变的检测 采用ＳＴＭＰ法Ｈ 检测 上述中国人３种常见的缺失型 一地贫突变，检测试剂盒由亚能 生物技术（深圳）有限公司生产（注册号：国食药监械（准）字 ２００８第３４０１２５１号），依其提供的使用说明书进行操作。ＰＣＲ 在ＰＥ２４００扩增仪（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ２４００，Ｐｅｒｋ ｉｎＥｌｍ ｅｒ）上进行。 扩增后，取３ Ｉ ＰＣＲ产物和０．８ Ｉ ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（深圳晶美生 物工程公司产品）在１×ＴＥＢ缓冲液、５～６ Ｖ／ｃｍ条件下， １．０ 琼脂糖凝胶电泳１ ｈ，溴化乙锭染色于ｕＶＰ凝胶成像仪 （ＵＶＰ Ｉｎｃ．，美国）下观察并记录结果。 １．３常见非缺失型ａ一地贫突变的检测 针对上述中国人常见 的３种非缺失型ａ一地贫基因突变则采用ＲＤＢ法【 检测，试剂 ２．１单管多重ＰＣＲ检测常见缺失型 一地贫的结果 健康人 或非缺失型ａ地贫只有１条１．８ ｋｂ的ａ 一珠蛋白基因的特异 性扩增带（泳道ｌ、５），若出现２．０ ｋｂ（泳道３、６、７、９）或１．６ ｋｂ （泳道４、７、１０）或１．３ ｋｂ（泳道２、８、９、１０、１１和１２），则分别指 示存在一０ｔ 、ａ 和一一 缺失型ａ一地贫基因的存在。 ２．２ ＲＤＢ检测常见非缺失型 地贫结果析，见表１。 将ＳＴＭＰ的凝胶 盒由亚能生物技术（深圳）有限公司提供，分子杂交仪则为美国 Ｒｏｂｂｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品。由于上述３种中国人常见的非缺 失型ａ地贫突变均发生在 一珠蛋白基因上，故在进行ＲＤＢ之 电泳特征图谱结合ＲＢＤ技术产前诊断ａ一地贫的结果进行分 表１ ＳＴＭＰ结合ＲＤＢ技术产前诊断 一地贫的结果分析 ＋：表示可见该长度片段的扩增带或ＲＢＤ杂交斑点。 ２．３产后追踪或随访 在７３例ａ一地贫产前诊断的胎儿中，共 留取了３９例脐血，其他的病例则进行了胎儿出生１周岁后血 液学验证或电话追踪随访，结果显示脐带血血红蛋白电泳所得 Ｂａｒｔ Ｓ水平以及随访结果与产前诊断结果完全吻合。 ３讨 论 妊娠晚期或出生后立即死亡，并大大增加了母体罹患严重的先 兆子痫、难产、产前（后）出血和羊水过多等致死性并发症的风 险ｌ８］。ＨｂＨ病严重影响患儿的生长发育和生活质量，也不是 一种良性疾病 ］。目前该病尚无根本有效的治疗方法，通过遗 传筛查、遗传咨询和产前基因诊断选择性地淘汰严重类型ａ地 贫胎儿则是控制该病发生的首要途径，其中产前诊断则占有举 足轻重的地位ｌｌ 。 ａ一地贫是中国长江以南地区、特别是广东、广西最常见、危 害最为严重的遗传性血液病之一。广东和广西人群中ａ一地贫 基因携带率分别高达８．５３％『２ 和１７．５５ ｌ７］。据此算出，广东 和广西分别每１３７个和３３个妊娠者就有１个生育严重类型ａ一 地贫胎儿（巴氏水肿胎和ＨｂＨ病）的风险。两省围产儿出生 缺陷监测数据显示：广东和广西Ｂａｒｔ Ｓ水肿胎发生率分别为 ２．４‰和３．５‰，各居围产儿出生缺陷第二（２００３年）和第一。 Ｂａｒｔ Ｓ水肿胎是致死性的疾病，几乎所有的患病胎儿均夭折于 产前诊断的结果直接决定了胎儿的生命，故保证产前诊断 结果的可靠性是临床遗传实验室一切工作的前提，否则其后果 是灾难性的、毁灭性的和不可挽回的。产前诊断的误差主要来 源于如下三方面，其一是操作人员因素（主要是责任心的问 题）；其二是样品因素，即样品有误，包括张冠李戴、母源污染和 样品错位等；其三是技术因素，即所采用的技术、试剂（试剂盒） 国际检验医学杂志２０１２年２月第３３卷第３期Ｉｎｔ Ｊ ＬａｂＭｅｄ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．３ ・ ２７３ ・ 的准确度、稳定性（重复性）如何。前二者可通过加强产前诊断 实验室的科学管理和产前诊断专业技术人员责任心的培养，改 进实验流程（如严格样品核收、实行移位法加液等）、设立 ＰＣＲ扩增体系的问题 由于检测中国人３种常见的非缺失型 ａ一地贫突变的ＲＤＢ试剂盒中，均未设立内对照，故可采用上述 方法对ＤＮＡ质量、ＰＣＲ反应体系和操作过程等进行确认，以 平行分析、进行家系分析和多态性连锁分析以判断采集或送检 的样品有无错误或有否母血污染等来克服。对于技术因素则 须通过常规应用两种不同原理的检测方法或技术进行地贫分 子诊断以控制偶然误差。由于实验的环节很多，每个环节上的 防假阴性结果的发生。 综上所述，从ａ＿地贫产前诊断的安全角度出发，要求临床 遗传实验室采用两种不同技术原理的方法或技术对检测结果 进行相互验证＿３］，但绝大多数临床遗传实验室受限于实验室条 件、技术水平和经济考虑等因素等，故难以在产前诊断实践中 推行。为此，本文采取变通的办法，将ＳＴＭＰ和ＲＤＢ技术结 疏漏或者不可预测的差异，都会出现结果与事实不符的事件发 生；同时由于个体差异，也不可避免出现某种不匹配的情况，如 应用分子杂交、ＰＣＲ技术时，因 、ａ 一珠蛋白基因序列的高度 合起来，同样可达到保证 地贫产前诊断准确度和可靠性的要 求，简便易行且经济，值得各临床遗传诊断实验窒借鉴。 同源性和高（Ｇ＋ｃ）含量而导致等位基因脱失（ｄｒｏｐｏｕｔ）口 或 偏性扩增『１ 或非特异性杂交等问题。 对于ａ一地贫的产前诊断，虽然报道的方法或技术很多，有 孕早期测定胎儿的心／胸比例的物理方法＿１ ，包括经典的 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析技术和无创伤性产前诊断技术ｒ１。 等ＤＮＡ 诊断方法，但诊断缺失型地贫和检测地贫点突变国际上通用和 国内比较成熟的分别还是ｇａｐ－ＰＣＲ／多重连接依赖的探针扩 增技术和ＭＬＰＡ和ＲＤＢ／变性高效液相色谱技术等口］。但在 临床遗传实践工作中，因实验条件、技术水平和经济因素等限 制，只有个别的地贫研究实验室同时采用ＭＬＰＡ和ＤＨＰＬＣ 或其他方法作为缺失型和非缺失型ａ一地贫产前诊断的验证方 法，故 一地贫产前诊断存在不容忽视的风险，值得临床遗传实 验室高度重视和采取必要的措施进行弥补。 根据国内地贫分子诊断实验室现有的实验条件、技术水平 和经济发展的现状，在不增加任何实验的前提下，采用综合分 析ＳＴＭＰ和ＲＤＢ检测的结果，就可有效地减少因未采用第二 种不同原理的方法或技术验证所造成的ａ～地贫产前诊断风险， 且产前诊断的结果与胎ＪＬｇＩ产或出生后脐血血红蛋白电泳和 追踪随访结果完全一致，证明该方案具有可靠性和可行性。由 于中国人常见的ａ 、ａ０ 和 ３种非缺失型ａ一地贫突变均发 生在ａ 一珠蛋白基因上，且扩增ｎｚ一基因的引物中有一条设计在 ＥＡ一～ 、一ａ 和～Ｒ４． ３种缺失型ａ一地贫基因公共缺失的部 分，运用ＲＤＢ技术检测上述３种缺失型突变的纯合子或双重 杂合子标本时，就无特异的ａ 一基因扩增片段产生，故ＲＤＢ膜 条上所有的野生型和突变型检测点均无信号，但ＳＴＭＰ则出 现特异的ＰＣＲ产物条带。而对于ＲＣＳ、ａ０ 和ａ 与一一 ＥＡ或一 ａ 或一ａ 。组合形成的各种基因型的标本，在ＳＴＭＰ检测中， 显示出与一一。队或一ａ 或一 杂合子一样的ＰＣＲ产物电 泳图谱，但在ＲＤＢ结果中，呈现ａ 、 ∞或ａ 纯合子突变结 果，此由一一 或一ａ 或一ａ 缺失了另一条同源染色体上 部分或全部ｎｚ一基因序列所致＿１ 。因此，运用ＳＴＭＰ和ＲＢＤ 技术同时检测同一标本，其结果具有相互验证的作用。临床遗 传实验室可利用ＳＴＭＰ和ＲＤＢ结果的互补优势进行产前ａ一 地贫基因，对于尚无条件开展ＭＬＰＡ、ＤＨＰＬＣ和其他ＤＮＡ诊 断方法的临床遗传实验室，目前仍不失为一种较为有效的变通 方法，从而保证产前 地贫基因诊断的准确度和可靠性。 由于严重缺失类型的ａ一地贫（如一～ 、一 。 或一ａ 自 身或相互组合形成的纯合子或双重杂合子）标本，采用ＰＣＲ结 合ＲＤＢ技术进行检测时，ＰＣＲ扩增无特异性扩增带产生，故 分子杂交后，ＲＤＢ膜条无杂交信号出现。遇到这种情况，首先 要检查室内质量控制是否在控，然后可将待检标本和正常对照 各一半组合成混合的标本，再进行扩增，如有特异的１．８ ｋｂ扩 增带出现，说明ＰＣＲ扩增体系运转正常。出现此种情况是因 待测标本本身ａ一珠蛋白基因大片段缺失所致，而非操作不当或 参考文献 ［１］周玉球，莫秋华，卢金汉，等．基于社区水平的珠海市大人群地中 海贫血的遗传筛查和产前诊断［Ｊ］．中华医学遗传学杂志，２００８， ２５（２）：２５６－２６１． ［２３ Ｘｕ ＸＭ，Ｚｈｏｕ ＹＱ，Ｌｕｏ ＧＸ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｈｅａｌｔｈ ｂｕｒｄｅｎ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，２００４，５７（３）：５１７—５２２． ［３］徐湘民．地中海贫血预防控制计划操作指南［Ｍ］．北京：人民军医 出版社，２０１０，１２：３４—３５． ［４］周玉球，张永良，李莉艳，等．单管多重ＰＣＲ快速检测中国人三种 常见缺失型ａ一地中海贫血基因［Ｊ］．中华医学遗传学杂志，２００５， ２２（２）：１８Ｏ一１８４． Ｅ５］李莉艳，莫秋华，徐湘民．反向点杂交快速诊断非缺失型ａ一地中海 贫血［Ｊ］．中华医学遗传学杂志，２００３，２０（２）：３４５—３４７． Ｅ６３周玉球，李文典．ａ一地中海贫血的表型筛查和基因诊断［Ｊ］．中国优 生优育杂志，２００１，１２（１）：１４３—１４５． ［７３ Ｘｉｏｎｇ Ｆ，Ｓｕｎ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅ— ｇｉｏｎ ｏｆ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ，２Ｏ１０。７８（２）：１３９—１４８． ［８３ Ｃｈｕｉ ＤＨ，Ｗａｙｅ ＪＳ．Ｈｙｄｒｏｐｓ ｆｅｔａｌｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａｌｐｈａ—ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ： ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ ｐｒｏｂｌｅｍ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９１（１９）：２２１３— ２２２２． ［９］Ｃｈｕｉ ＤＨ，Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ Ｓ，Ｃｈａｎ Ｖ．Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｈ ｄｉｓｅａｓｅ：ｎｏｔ ｎｅｃｅｓ— ｓａｒｉｌｙ ｆｌ ｂｅｎｉｇｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ［Ｊ￣．Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１（６）：７９１—８００。 ［１０］Ｏｌｄ Ｊ，Ｔｒａｅｇｅｒ—Ｓｙｎｏｄｉｎｏｓ Ｊ，Ｇａｌａｎｅｌｌｏ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈａｌａｓｓｅ— ｍｉａｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ［Ｍ］．１ｓｔ ｅｄｓ．Ｎｉｃｏｓｉａ：Ｔｈａｌａｓｓｅ～ ｍｉａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ，２００５，８：８５—８６． ｒ１１］Ｗａｒｎｅｃｋｅ ＰＭ，Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ Ｃ，Ｍｅｌｍ ＪＲ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｒｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｓ— ｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ＰＣＲ ｂｉａｓ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｓｕｌ ｐｈｉｔｅ—ｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ［－Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９９７，２５（２３）：４４２２— ４４２６． ［１２］Ｌａｉｎ ＹＨ，Ｔａｎｇ ＭＨ，Ｌｅｅ ＣＰ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｅｎａｔａｌ ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｒｅ— ｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｔｙｐｅ １ ａｌｐｈａ—ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ ａｔ １ ２ ｔｏ １ ３ ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｇｅｓｔａｔｉｏｎ［Ｊ￣．Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９９９，１８０（１）：１４８—１５０． ［１３］严提珍，徐湘民．母体血浆胎儿核酸分析应用于地中海贫血的无 刨性产前诊断［Ｊ］．国际输血及血液学杂志，２００９，３２（３）：５０１— ５０８． ［１４］Ｆｏｇｌｉｅｔｔａ Ｅ，Ｂｉａｎｃｏ Ｉ，Ｍａｇｇｉｏ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ ｃｏｍ— ｍｏｎ Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｎｏｎ－Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ａｌｐｈａ—ｔｈａｌａｓｓｅ－ ｍｉａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｄｏｔ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａ— ｔｏｌ，２００３。７４（１）１１９１－１９５． （收稿日期：２０１１－１０－０９）
