微流控芯片单细胞分析

姓名：何鹏申请学位级别：硕士专业：有机化学指导教师：孙雪梅

20090415

青岛科技大学研究生学位论文微流控芯片单细胞分析摘要检测单个细胞内化学组分，有助于理解基本细胞功能，有助于检测和鉴别大量细胞群体中少量的不正常细胞。因此单细胞的研究在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究方面有重要意义。微流控芯片微米尺寸的通道适于单细胞引入，操纵，反应，分离及检测，因此用微流控芯片技术对生物细胞的研究引起了广泛注意，近些年来得到快速发展。在这一分析平台上建立简便、快捷、灵敏的分离测定方法并将其应用于单细胞分析具有重要的学术意义和应用价值。本论文围绕开发微流控芯片新的分离分析方法并应用于单细胞分析这一目标展开研究。本论文共分为六章，内容如下：第一章，首先对微流控芯片的基本原理进行了简单的介绍。然后对微流控芯片在单细胞分析中的应用进行了详细的综述，并介绍了电化学发光检测技术在微流控芯片中的应用。第二章，采用了毛细管电泳柱前萘．２，３．二甲醛（ＮＤＡ）衍生的方法测定牛磺酸，考察了ＮＤＡ衍生条件、检测电势、分离电压、缓冲溶液ｐＨ值、缓冲溶液浓度等实验参数对牛磺酸检测的影响。最佳实验条件是缓冲溶液为ｐＨ＝１１．０４的８．００ｘ１０一ｍ０１．Ｌ１Ｎａ２８４０７中，衍生反应时间３０ｍｉｎ，分离电压为２０ｋＶ，检测电势为Ｏ．９０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）。在此条件下，５．０ｋＶ进样１０ｓ，得到牛磺酸的线性范围为５．００ｘ１０。６￣１．００ｘ１０一ｍ０１．Ｌ－ｌ，线性回归系数为０．９９９７，浓度检出限ＬＯＤｃ为１．６０ｘ１０石ｍ０１．Ｌ－１（洲＝３），对１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌｏ牛磺酸衍生物进行６次平行检测，得到牛磺酸衍生物的迁移时间‰和峰电流ｉｐ的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为１．７％和２．５％。用该方法检测人溶血样中牛磺酸的含量，加标回收率在９３．９５％之间。第三章，以ＰＤＭＳ／玻璃芯片为制作材料，研制了一种集成芯片毛细管电泳电化学检测器，在正对分离通道末端的位置固定一微型引导管，用以定位和固定工作电极。借助该电极引导管，无须外部的辅助定位装置，即可方便、快速、准确地实现工作电极端面与毛细管出ＩＳｌ对准，以抗坏血酸（ＡＡ）和多巴胺（ＤＡ）为模拟分析物，考察了芯片的分离效果。并以对抗坏血酸的检测考察了整个分析系统的重现性，重复安装工作电极所引起的抗坏血酸的峰电流的相对标准偏差（ＲＳＤ）仅为３．１％，重现性良好。第四章，采用自制的微流控芯片电化学检测装置，以碳纤维簇微盘电极为工作电极测定了大鼠腹腔肥大细胞溶膜液中抗坏血酸的含量。检测抗坏血酸的最佳实微流控芯片单细胞分析验条件是，缓冲液为ｐＨ９．０的１．０×１０。２ｔｏｏｌ·Ｌ。１的硼酸缓冲溶液，分离电压为１．１ｋＶ，检测电势为Ｏ．８Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ），进样方式为１．ＯｋＶ电迁移进样５Ｓ。在此实验条件下，得到了抗坏血酸的线性范围（８．０ｘ１０＊．５．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１），线性回归系数为０．９９８５，，并以电泳峰电流与噪声比值（Ｓ／Ｎ）为３时得到浓度检测限为２．７×１０击ｍｏｌ·Ｌ－１。将５．Ｏ×１０４ｍｏｌ·Ｌ－１抗坏血酸标准溶液连续进样７次，得到抗坏血酸的迁移时间‰和峰电流乇的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为Ｏ．５７％和２．１％，并将该方法用于检测大鼠肥大细胞溶膜液中的抗坏血酸含量，加标回收率在９４．９７％之间。第五章，研制了一种新型的碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰的碳纤维簇微盘电极，并将其用于微流控芯片电化学检测，测定了单个大鼠肥大细胞中的抗坏血酸。与未经修饰的碳纤维微盘电极相比，这种碳纳米管／纳米普鲁士蓝碳纤维微盘修饰电极在相对较低的检测电位下（＋Ｏ．４Ｖ凇．Ａｇ／ＡｇＣｌ）具有较好的催化氧化特性，灵敏度显著提高。在最佳实验条件下，得到抗坏血酸的线性范围为８．０ｘｌｆｆ７－５．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１，检测限为２．７×１０～ｍｏｌ·Ｌ～（Ｓ／Ｎ－３）。将５．Ｏ×１０～ｍｏｌ·Ｌ－１抗坏血酸标准溶液连续进样７次，得到抗坏血酸的迁移时间‰和峰电流乇的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为０．８６％和２．３％。在这一方法中，单个细胞通过电迁移导入芯片的双Ｔ交叉点，在１．０ｌ（ｖ的电压下肥大细胞迅速溶膜，溶膜后细胞中的组分在微流控芯片中得到分离并检测。用上述方法测得单个大鼠腹腔肥大细胞中抗坏血酸的含量为２．５—７．３ｆｍｏｌ，这是使用碳纤维修饰电极在微流控芯片上对单个大鼠肥大细胞中组分含量测定的首次报道。第六章研制了一种集成化微芯片毛细管电泳电化学发光检测系统，并在该系统上，以碳纤维簇微盘电极为工作电极，Ｒｕ（ｂｐｙ）３ｚ＋作为发光试剂，考察了发光试剂的浓度、缓冲液的ｐＨ值、缓冲液浓度、分离电压、检测电势等实验参数对检测谷胱甘肽的影响，得到的最佳检测条件为：Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的浓度为１．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ～，３．８ｘ１０～ｔｏｏｌ·Ｌ＿１ＮａＨ２Ｐ０４．１．６８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４（ｐＨ７．４），分离电压为１．２ｋＶ，检测电势为１．４Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ），进样电压１．ＯｋＶ，进样时间５Ｓ。在此实验条件下，将１．Ｏ×１０４ｍｏｌ·Ｌ－１谷胱甘肽标准溶液连续进样７次，得到谷胱甘肽的迁移时间岛和峰电流Ｊ的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为０．９２％和２．１％。这是首次将Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋电化学发光与微流控芯片联用技术用于谷胱甘肽的分析。关键词：单细胞分析；微流控芯片；电化学检测；电化学发光检测；碳纤维簇微盘工作电极；化学修饰电极青岛科技大学研究生学位论文ＳＩＮＧＬＥ—ＣＥＬＬＡＮＡＬＹＳＩＳＢＡＳＥＤＯＮＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣＣＨＩＰＡＢＳＴＲＡＣＴＳｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓｉｓｏｆｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｔｅｒｅｓｔｔｏｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｍｅｄｉｃａｌ，ａｎｄｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，ｂｅｃａｕｓｅｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｃｅｌｌｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｉｔｔｏａｂｅｔｔｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｂａｓｉｃＣａｎａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｅｌｌ·－ｔｏ－－ｃｅｌｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｌａｒｇｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｃｅｌｌｓ．Ｒｅｃｅｎｔｌｙｔｈｅｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ－ｂａｓｅｄｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｓｃｅｌｌｓｔｕｄｉｅｓｉｓａｔｔｒａｃｔｉｎｇｂｒｏａｄｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｓｕｃｈｓｙｓｔｅｍｓ，ｍｏｒｅｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓｍＴＡＳ），ｈａｄｇｏｎｅｔｈｒｏｕｇｈｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｈｅｐａｓｔｄｅｃａｄｅ．Ｔｈｅｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒｃｈａｎｎｅｌｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓａｒｅｉｄｅａｌｌｙｓｕｉｔｅｄｆｏｒｔｈｅｓａｍｐｌｅｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌｖａｌｕｅｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓ．Ｉｔｈａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｃａｄｅｍｉｃｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｓｗｏｒｋＷａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｔｏｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｔｈｅｓｅａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄｐｏｉｎｔｓ．Ｔｈｅｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ａｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔｓ，ｃｏｎｔａｉｎｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｉｘｃｈａｐｔｅｒｓ．Ｉｎｔｈｅｃｈａｐｔｅｒｏｎｅ，ｆｉｒｓｔｏｆａｌｌ，ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐＷａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓＷａｓｂｒｉｅｆｌｙ．Ｔｈｅｎｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｉｎｒｅｖｉｅｗｅｄｉｎｄｅｔａｉｌ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅｗｏｒｋｆｏｒｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＷａｓｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｉｎｔｈｅｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｕｓｉｎｇｃｈａｐｔｅｒｔｗｏ，ａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔａｕｒｉｎｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｂｙｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｏｆ２，３－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ—ｄｉｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ（ＮＤＡ）ｐｒｅ．ｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨ，ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍ１１．０４）ｆｏｒｔｈｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅ８．ＯＯｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７（ｐＨｔｈｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ，２０ｋＶｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，ａｎｄ０．９ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ＴｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉＳ１．６０ｘ１ｒａｎｇｅｉｓ５．ＯＯｘ１０－６－Ｉ．ＯＯｘ１００ｍｏｌ·Ｌ．１ｗｉｔｈａＶ（ｖｓ．ＳＣＥ）ｆｏｒ０由ｍｏｌ·Ｌ－１（Ｓ／Ｎ＝３１ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｆ０．９９９７ｆｏｒｔｈｅａｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅｏｆ５ｋＶａｎｄｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ１０Ｓ．Ｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｆｏｒｓｅｒｉｅｓｏｆ微流控芯片单细胞分析ｓｅｖｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆ１．ＯＯｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ。１ｔａｕｒｉｎｅｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆ１．７％ｆｏｒｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ．ａｎｄ２．５％ｆｏｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｅｄｔａｕｒｉｎｅｂｏｔｈｉｎｎｏｒｍａｌｈｅｍｏｌｙｓｉｓａｎｄａｂｎｏｒｍａｌｈｅｍｏｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｂｅｔｗｅｅｎ９３－９５％．Ｉｎｔｈｅｃｈａｐｔｅｒｔｈｒｅｅ，ａＰＤＭＳ／ｇｌａｓｓｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ谢ｍｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｅｌｌｅｑｕｉｐｐｅｄｂｙｒｅｐｌａｃｅａｂｌｅｍｉｃｒｏ—ｄｉｓｋｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅＷａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ｔｈｅｅｎｄ—ｃｈａｎｎｅｌａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｅｄａｇｕｉｄｅｔｕｂｅｆｏｒａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅ，ｗｈｉｃｈｍａｄｅｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏｄｉｓｋｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｄｏｎｅｐｒｅｃｉｓｅｌｙｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｈｅｌｐｏｆａｍｉｃｒｏ－ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｒ．Ｕｓｉｎｇａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ（ＡＡ）ａｎｄｄｏｐａｍｉｎｅ（ＤＡ）ａｓｔｈｅｍｏｄｅｌＰＤＭＳ／ｇｌａｓｓａｎａｌｙｔｅｓ，ｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｂｅｃａｒｒｉｅｄｏｆｔｈｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐＷａｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃａｎｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｔｏｔｈｅｃｈａｎｎｅｌｏｕｔｌｅｔｏｕｔａｃｃｕｒａｔｅｌｙａｎｄｑｕｉｃｋｌｙ．Ｇｏｏｄｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｗａｓａｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｂｙ３．１％ＲＳＤｆｏｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔｏｆＡＡｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｒｅｐｅａｔｅｄｌｙｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆａｍｉｃｒｏ－ｄｉｓｋｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．Ｉｎｔｈｅｃｈａｐｔｅｒｆｏｕｒ，ｔｈｅｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ－ＥＤ）ｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｆｏｒｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｌｙｓｉｓｗｉｔｈａｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｒａｔｂｕｎｄｌｅｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏｄｉｓｋｅｌｅｃｔｒｏｄｅ（ＣＦＭＢＥ）．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅ１．ＯｘｌＯ～ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０）ｆｏｒＡｇ／ＡｇＣｌ）ｆｏｒｔｈｅｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ，１．１ｋＶｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，ａｎｄ０．８Ｖ（ｖｓ．ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｉｓ２．７ｘ１０曲ｍｏｌ·Ｌ－１（Ｓ／Ｎ＝ｃｏｅｍｃｉｅｎｔｏｆ３）ａｎｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｉＳ８．０ｘ１０－％５．Ｏ×１０’４ｍｏｌ·Ｌ＿ｗｉｔｈ０．９９８５ｆｏｒｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｅｖｅｎｖｏｌｔａｇｅｏｆ１．０ｋＶａｎｄｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ５Ｓ．Ｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅａｆｏｒａｓｅｒｉｅｓｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆ５．０ｘ１０。４ｍｏｌ·Ｌ。１ＡＡｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆＯ．５７％ｆｏｒｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ．ａｎｄ２．１％ｆｏｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｍｅｔｈｏｄＷａｓｕｓｅｄｔｏｃｅｌｌｓｌｙｓｉｓ．ＴｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄＷａｓＩｎｔｈｅｃｈａｐｔｅｒｆｉｖｅ，ａｋｉｎｄｏｆｎｏｖｅｌｃａｒｂｏｎｄｅｔｅｃｔａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔ９４．９７％．ｂｅｔｗｅｅｎＣＦＭＢＥｗｉｔｈｄｏｕｂｌｅｍｏｄｉｆｉｅｒｓ．ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄｎａｎｏｔｕｂｅｓ（ＭＷＣＮＴｓ）ａｎｄｐｏｌｙ（ｄｉａｌｌｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）ｐｒｏｔｅｃｔｅｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（Ｐ—ＰＢ）ｉｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ－ＥＤｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＣＦＭＢＥＡＡｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＭＷＣＮＴｓ／Ｐ－ＰＢＣＦＭＢＥａｔａｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｂｖｉｏｕｓｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｌｏｗｅｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ（＋０．４ＶＳ．Ａｇ／ＡｇＣＩ）．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｓ２．７ｘ１０～ｍ０１．Ｌ＿１（Ｓ／Ｎ＝３１ａｎｄｔｈｅＩＩｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｉｓ８．Ｏｘｌ０－７＿５．Ｏｘｌ０。４ｔｏｏｌ·Ｌ．１ｗｉｔｈｒｅｓｐｏｎｓｅｆｏｒａａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆ０．９９８１．Ｔｈｅａｓｅｒｉｅｓｏｆｓｅｖｅｎｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆ５．０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１ＡＡｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｌｍｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆ０．８６％ｆｏｒｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ．ａｎｄ２．３％ｆｏｒｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｐｅａｋｃｕｒｒｅｎｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｓｉｎｇｌｅｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｉｎｔｈｅｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｏｔｈｅｄｏｕｂｌｅ—Ｔｃｒｏｓｓｉｎｇｂｙｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｆｌｏｗ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌＷａｓｌｙｓｅｄｒａｐｉｄｌｙｕｎｄｅｒｔｈｅｈｉｇｈｅｌｅｃｔｒｉｃｆｉｅｌｄ．ＡＡｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌＷａｓｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙｍｉｇｒａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｎｄｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌａｎｄｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｏｎｔｈｅＷＣＮＴｓ／Ｐ·ＰＢＣＦＭＢＥａｔ＋ｏ．４Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）．ＴｈｅａｍｏｕｎｔｏｆＡＡｉｎｓｉｎｇｌｅｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏｂｅ２．４－７．１ｆｍ０１．ＴｈｉｓｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆＡＡｉｎｓｉｎｇｌｅｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ－ＥＤｕｓｉｎｇＭＷＣＮＴｓ／Ｐ—ＰＢＣＦＭＢＥ．Ｉｎｔｈｅｃｈａｐｔｅｒｓｉｘ，ＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＧＳＨＷａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｔｈｅｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｍｉｃｍｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｂａｓｅｄｏｎｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）（Ｒｕ（ｂｐｙ）３２十）．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓＲｕ（ｂｐｙ）３７２＋，ｒｕｎｎｉｎｇｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃａｒｅｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｏｎｂｕｆｆｅｒｐＨ，ｒｕｎｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅｃｈｉｐ—ＥＣＬｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎＮａＨ２Ｐ０４．１．０ｘ１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１ｆｏｒｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＲｕ（ｂｐｙ）３２＋，３．８ｘ１０。ｍｏｌ·Ｌ－１１．６８ｘｌＯ－Ｉｍｏｌ。Ｌ－１Ｎａ２１－ＩＰ０４①Ｈ７．４）ｆｏｒｔｈｅＳｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎ，１．２ｋＶｆｏｒｍｅｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，１．０ｋＶａｎｄ５ｆｏｒｔｈｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅａｎｄｉｎｊｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄ１．４Ｖ（ｖｓ．ｓｅｖｅｎＡｇ／ＡｇＣｌ）ｆｏｒ１．０ｘｌ０４ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ＴｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｆｏｒＧＳＨｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎａａｓｅｒｉｅｓｏｆｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆｍ０１．Ｌ－１ｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎｏｆ０．９２％ｆｏｒｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄ２．１％ｆｏｒｔｈｅＥＣＬｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｓｉｎｇｌｅ—ｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓ；ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏ－ｄｉｓｋｂｕｎｄｌｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅＩＩＩ青岛科技大学研究生学位论文符号与缩写ＣＥ：毛细管电泳ＬＩＦ：激光诱导荧光检测ＥＯＦ：电渗流ＦＩＡ：流动注射分析ＭＣＣＥ：微芯片毛细管电泳ＨＰＬＣ：高效液相色谱ＣＥ．ＥＣＤ：毛细管电泳电化学检测ＳＤＳ：十二烷基硫酸钠ＣＥ．ＥＣＬ：毛细管电泳电化学发光检测ＭＬＣＴ：金属到配体三重电荷传递态ＥＣＬ：电化学发光ＭＥＭＳ：微机加工技术ｌａＴＡＳ：微全分析系统ＳＣＥ：饱和甘汞电极Ａｍ；抗坏血酸ＤＡ：多巴胺ＣＦＭＢＥ：碳纤维簇微盘电极ＧＳＨ：还原型谷胱甘肽ＧＳＳＧ：氧化型谷胱甘肽ＬＯＤｃ：浓度检出限ＣＭＥ：化学修饰电极ＰＢ：普鲁士蓝ＣＮＴｓ：碳纳米管ＭＷＣＮＴｓ：多壁碳纳米管ＰＤＤＡ：聚二烯丙基二甲基氯化铵Ｐ．ＰＢ：ＰＤＤＡ保护的纳米普鲁士蓝ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ一２．二甲基甲酰胺ＮＤＡ：萘．２，３．二甲醛ＰＤＭＳ：聚二甲基硅氧烷ＩＴＯ：铟锡氧化物微流控芯片单细胞分析独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：签字日期：年月臼关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。不保密口。本人签名：签字日期：签字日期：年年月日导师签字：痂乡争抽月日青岛科技大学研究生学位论文弟一早义卧练迎第一章文献综述为了适应生命科学发展的需要，分析仪器的发展正在出现一个以微型化为主要特征的、带有性的重要转折时期【ｌＪ。随着微机电加工技术（Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＥＭＳ）被Ｍａｎｚ等引入分析学科，微型全分析系统”（Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｓｙｓｔｅｍｓ，或Ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ，ｐ－ＴＡＳ）或称微流控分析系统应运而生【ｌ，３】。并在此后十余年中该领域已发展为当前世界上最前沿的科技领域之～，并将继续对分析科学乃至整个科学技术的发展发挥重要的推动作用。肛．ＴＡＳ的目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上。“芯片实验室”在分析系统微型化、集成化的基础上，Ｉ／－ＴＡＳ的最终目标是实现分析实验室的“个人化”、“家用化”，从而使分析科学及分析仪器从化学实验室出来，进入千家万户。微流控芯片是利用微加工技术在芯片上制做微阀、微通道、微反应器、微传感器、微检测器等功能单元而构成的微型化学系统，在该系统中可完成样品的前处理、化学反应、分离、检测等功能【４剖。它最集中地体现了将分析实验室的功能转移到芯片上的思想，是¨．ＴＡＳ中当前最活跃的领域和发展前沿，是当今分析仪器发展的前沿，其未来的发展将对上述目标的实现起到至为关键的作用。１．１微流控芯片毛细管电泳１．１．１微流控芯片的基本原理在微流控芯片分析系统中，微流体的驱动技术是实现微流体控制的前提和基础，通过对微流体的控制完成芯片系统的分离分析功能。在众多的驱动方式中，如压电微泵驱动、气动微泵驱动、离心力驱动等，电渗流（ＥＯＦ）驱动是微流控芯片中使用最广的驱动技术。微流控芯片毛细管电泳简称芯片毛细管电泳，就是基于这种电渗驱动方式的一种微流控芯片。ＣＥｃｈｉｐ是在玻璃、石英、硅、塑料等芯片的微通道中，以电场为驱动力，借助于离子或分子在电迁移或分配行为上的差异，对复杂试样中的多种组分进行高速分离分析的技术。芯片毛细管电泳分离分析的基本原理与传统的毛细管电泳类似，但在形式上却完全不同。它是采用微机电加工技术在几平方厘米大小的基片上通过刻蚀等方法制作出宽度为微米级的狭长通道网络，并和其它功能单元如样品前处理、反应器、检测器等组成的集进样、分离、检测等功能为一体的微分析系统。有关芯片毛细管电泳的第一篇报道微流控芯片单细胞分析是在１９９２年由Ｍａｎｚ等人发表的【１１。他们以荧光染料为分析对象，研究了在芯片微通道网络中以电渗为驱动力实施进样和分离的可能性，展示了芯片毛细管电泳的雏形。近几年，芯片毛细管电泳引起了全世界分析工作者的重视并快速发展起来。１．１．１．１电渗流在毛细管中，电渗流（ｅｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃｆｌｏｗ，简称ＥＯＦ）是指体相溶液在外加电场作用下整体朝一个方向运动的现象。在玻璃、石英等材料芯片的微通道中同样存在电渗现象。在通常的毛细管区带电泳条件下，电渗流从阳极流向阴极。其大小受至ｌＪｚｅｔａ电势、双电层厚度和介质粘度的影响。一般来讲，ｚｅｔａ电势越大，双电层越薄，粘度越小，电渗流值越大。电渗的淌度∥ｅｏ可表示为／ｚ∞＝￡知／４ｎｒｌ（１）ｂ为管壁的ｚｅｔａ电势，电渗流的速度通常是泳流速度的５．７倍。因为同时存在着电泳流和电渗流，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内的运动速度应当是两种速度的矢量和，即：ｙ－印＋‰＝（∥印＋∥。ｏ）Ｅ（２）令∥ａｐｐ＝∥印＋∥∞为表观淌度，即可以得到毛细管电泳测量中的淌度，应为粒子自身的电泳淌度和电渗流淌度之和，可以通过下式直接求得：，Ｕａｐｐ＝∥印＋∥ｃｏ＝ｙ／Ｅ＝Ｌｄ－，ｔ／矗Ｖｈ（３）其中厶，为毛细管从进样口到检测器的距离；矗，是粒子通过这段距离所用时间；Ｌ。，是柱的全长；％，是电压；Ｅ＝％／厶。正离子的运动方向和电渗流一致，最先流出；中性粒子的泳流速度为“零”，随电渗流而行；负离子运动方向和电渗流相反，当电渗流速度大于电泳速度时，它在中性粒子之后流出，反之则无法流出。因此，如果电渗流速度的绝对值大于所有负离子泳流速度的绝对值，则此混合物中的所有组分将朝一个方向迁移。电渗流是毛细管电泳的一个重要特征和物理现象，受电场强度、毛细管材料、缓冲液ｐＨ值、缓冲液成分与浓度、添加剂和温度影响【６，７１。利用不同方法，例如调节电场强度，改变缓冲液ｐＨ、离子强度或缓冲液浓度、温度，添加有机改性剂、表面活性剂、中性亲水聚合物，毛细管共价涂渍物改性等，通过改变上述条件可以对ＥＯＦ的大小和方向进行控制，可以改善ＣＥ的分离效率、选择性和分离度，成为优化分离条件的重要参数。有效地控伟ＩＪＥＯＦ，对提高分离效率，改善分离度，特别是提高ＣＥ分离重现性具有非常重要意义。目前，用来控￥ＩＪＥＯＦ的方法主要有以下几种瞵１（１）改变缓冲溶液成分和浓度；（２）改变缓冲溶液ｐＨ；２青岛科技大学研究生学位论文（３）加入添加剂；（４）毛细管内壁改性——物理或化学方法涂层及动态去活；（５）改变温度；（６）外加径向电场。１．１．１．２分离效率和分离度芯片毛细管电泳的分离效率同传统的毛细管电泳一样，可以用理论塔板数（ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｐｌａｔｅｓ，聊表示，其理论表达来源于色谱理论，用Ｇｉｄｄｉｎｇｓ方程定义为：Ⅳ＝产／０２（４），为迁移距离，即有效长度，０２是区带中浓度分布的方差（ｖａｒｉａｎｃｅ）。用理论塔板高骧示：日＝Ｌ／Ｎ（５）三为毛细管长度，理论塔板数（加可以由反映分离结果的色谱图直观地计掣９】，对于具有高斯型的电泳峰，Ⅳ由下式求得：Ｎ＝５．５４（ｔｒ／叨２分分开的能力，可表示为：Ｒｓ＝２（ｔａ－ｔｒｌ）／（％＋％）＝（ｔａ—ｔｒｌ）／４Ｃ２（７）（６）矗为迁移时间，瞒半峰宽。分离度俾ｓ），也称分辨率，是指将淌度相近的组下标１和２分别代表相邻两个物质，矗为迁移时间，瞒以时间表示的基线峰宽，０２表示方差。因此上式分子代表两种物质迁移时间之差，分母则表示这一时间间隔组分展宽对分离的影响。１．１．２微流控芯片的检测器及检测方法微流控芯片检测器的作用是测定被分析样品经微流控分析芯片系统分离或处理后有关组份的组成及其含量。检测器的总体性能将影响整个微流控芯片分析系统的检出限、检测速度、适用范围、体积等指标，是微流控芯片分析系统的一个关键部份，有关检测方法和检测器的研究已成为微流控领域的一个重点和热点【ＩｏＪ。基于不同检测原理的众多检测方法都被用于微流控芯片分析的研究中。微流控芯片检测器一般按其检测原理进行分类，大致可以分为光学检测器、电化学检测器、质谱检测器等。ＭｉｃｒｏｃｈｉｐＣＥ目前常用的检测方式是激光诱导荧光检测。该法具有极高的灵敏度，一般可达１０一ｍｏｌ·Ｌ．１１０叫２ｍｏｌ·Ｌ．１，可检测单细胞中的核酸等物质，甚至可对某些荧光效率高的物质进行单分子检测。但其检测对象必３微流控芯片单细胞分析须能产生荧光或经衍生能产生荧光，对于大多数非荧光物质，需柱前或柱后衍生才可检测，这就使设备和操作复杂化，且对于透光性差的基体，荧光检测难以应用；另外，激光诱导荧光检测器造价昂贵，需要体积庞大、技术复杂的光学系统支持，难以真正实现微分析系统的微型化和集成化。电化学检测具有灵敏度高、选择性好、试样用量少、不受管径、对检测部位的透光性无要求、成本低、易于集成化、微型化等优点，与先进的微加工、微制作技术相匹配，具有实现大规模生产的潜力，因此电化学检测应用于ＭｉｃｒｏｃｈｉｐＣＥ的研究受到越来越多的关注。其中，安培法是应用较多的电化学方法，此外还有电导法、电化学发光法等。根据电化学检测原理的不同，目前在微流控分析系统中所采用的电化学检测方法主要有安培检测法、电导检测法和电位检测法。１．１．２．１安培检测安培检测法根据待测物在恒（或脉冲）电位工作电极上发生电化学反应时所产生的氧化电流或还原电流对待测物进行定量的检测方法，它的灵敏度接近激光诱导荧光法，且有一定的选择性。但安培法不是通用的检测方法，它要求测定对象在所选用的电极上具有电化学活性。１９９８年，Ｍａｔｈｉｅｓｄｘ组【１ｌ】首次报道了将安培检测集成在毛细管电泳芯片上。通过等离子溅射的方法在玻璃基底上制作条状的ＰｔＴ作电极和对极，以直径２５０｝ａｍ的Ａｇ／ＡｇＣｌ电极为参比电极。工作电极设计成双头，距离毛细管出Ｎ３０ｇｍ，伸入１ｒｎｎｑ宽的检测池中，以减小工作电极处分离电压的干扰。固定工作电极与参比电极间ｇ巨３００ｌｘｍ，检测了神经递质多巴胺、肾上腺素、儿茶酚胺，分离效率分别达２１０００，１７０００，１２０００／米理论塔板数，检测限分别达３．７，６．５，１２ｌｘＭ。Ｋｕｈ等１１２Ｊ发明一种基于频率检测的电化学方法检钡ＪＪＤＮＡ序列，２０个碱基序列的引物５．端共价键合４种氧化还原物质，施加正弦伏安可以区分这几种电化学标记物。几种标记物选择不同取代位的二茂铁衍生物，不同的取代位导致不同的给、吸电子效应，从而形成特征半波电势。所以，每个标记物具有独特的正弦频谱，由主频区分出来。标记后的单核苷酸毛细管凝胶电泳分离后检测，分离效率２×ｌＯ击／ｍ，因此可以进行低精度的ＤＮＡ序列测定。Ｎｙｈｏｌｍ等【１３】提出一种无恒电位仪ＣＥ安培检测方法，其原理是利用置于电场中的微带阵列电极之间的电势差进行检测。毛细管出口安装两个微带电极，分离电压决定两电极之间的电势差和产生的电化学电流，其结果类似循环伏安得到的电化学响应电流形状。Ｂａｌｄｗｉｎ和其合作者【１４Ｊ报道了一种设备齐全的便携式芯片电泳电化学检测集成系统。他们的计算机模拟实验表明样品塞在分离管道出口处扩散成为新月型，为了优化检测，他们将工作电极的形状也设计成类似的新月型，有效地增加了样品和工作电极的接触４青岛科技大学研究生学位论文面，提高了检测的信噪比。安培检测器的性能很大程度上取决于所选择的工作电极的材料。电极材料的选择需同时考虑待测物的反应活性能及背景电流的大小。目前在Ｃｈｉｐ．ＣＥ安培检测器中使用较多的工作电极为碳电极、金属电极及化学修饰电极。（１）碳电极在Ｃｈｉｐ．ＣＥ中，安培检测器多采用碳素墨水、碳糊等材料通过微加工技术制作碳电极。Ｌｕｎｔｅｄｘ组【１５，１６】设计了毛细管电泳芯片碳双电极安培检测器。并在ＰＤＭＳ芯片上集成了碳糊工作电极。方禹之等【１７，１８］先后研制了新型碳糊电极，成功实现了对几种糖以及几种糖类物质与抗坏血酸的混合体系的毛细管电泳安培检测。（２）金属电极Ｃｈｉｐ．ＣＥ安培检测器使用最多的金属电极是金膜电极和铂电极，制作技术有喷涂法、光刻法等。制作金属微电极最简单的方法是将金属丝直接对准并固定在毛细管通道出口处。Ｈｅｎｒｙ等ｔ１９】使用２５ｌｘｍ的Ｐｔ丝在陶瓷芯片上制作了流经式工作电极，Ｌｕｎｔｅｄｘ组【２０】首次在芯片玻璃基底上制作Ｔ４个微金电极，电极间距４０岬。硅橡胶层中制作出分离和进样管道，硅橡胶层和玻璃基底可逆地密封在一起，最靠近毛细管出口的两个电极作为双电极，以儿茶酚为被测物，检测限４ｐ．Ｍ，线性范围１０至５００ｌａＭ，收集效率２５．９％至２８．７％，该系统对电化学可逆的物质可进行选择性检测。（３）化学修饰电极通过对电极表面进行化学修饰可以有效地提高其检测性能，扩大应用范围。Ｗａｎｇ等ｔ２ｌ】制作的钻酞菁碳糊修饰电极对联胺类物质进行毛细管芯片电泳．电化学检测，检测电位只需＋Ｏ．５０Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ），催化效果明显。Ｗａｎｇｄ、组【２２】报道了在筛印碳电极表面修饰单壁或多壁碳纳米管，即涂覆１“Ｌ含有２ｍ咖Ｌ，单壁或多壁碳纳米管和Ｏ．５％Ｎａｔｉｏｎ的乙醇溶液，该电极所需操作电压低，同时能显著的强信噪比，又有广而宽的催化活性。分析分离了脐类、苯酚类和氨基酸。１．１．２．２电导检测电导检测是根据带电组分对溶液电导率的贡献而进行检测的。因此，只要是离子型组分即可检测，是一种通用型检测器。Ｇｒａｓｓ等【２３】比较详细的介绍了在ＰＭＭＡ基片上制作等速电泳一电导检测的芯片的方法。并用于测定Ｎ０３。等无机阴离子和乙酸等有机酸【２４】。Ｇａｌｌｏｗａｙ等【２５】在ＰＭＭＡ的ＣＥ芯片上采用在柱接触电导检测，分析单价阳离子以及多价态阳离子物质。检测器包括一对直径１２７ｌｘｍ的Ｐｔ丝电极，末端间距２０Ｉ．ｔｍ，安装于通道的内部。电极上施加频率５ｋＨｚ的双极脉冲以减小充电电流，并在每个脉冲的后期记录电流信号，提高检测灵敏度。可检测氨基酸、肤、蛋白质、单核昔酸等物质，氨基酸的检测限达８ｎＭ。Ｈａｕｓｅｒｄ，纠２６】使用交５微流控芯片单细胞分析流激发电压（５００导检测器。Ｖ，１００ｋＨｚ）日ａ容偶合技术对芯片毛细管电泳进行无接触电导检测。最近，Ｗａｎｇｄ、组‘２７１又在ＰＭＭＡ材料的ＣＥ芯片上集成了可移动的无接触式电１．１．２．３电位检测与安培检测和电导检测相比，微流控芯片上的电位检测器少得多。Ｍａｎｚ，ｂ组ｔ２８】报道了与微流通池集于～体的选择性微电极。该微流控芯片刻有一条ｕ型通道和一条直线型通道。Ｕ型通道内充有能响应Ｂａ２＋的溶剂高聚物膜。直线型通道为试样通道。据报道，该电位检测器在１０～．１０击ｍｏｌ·Ｌ－１浓度范围对Ｂａ２＋呈线性响应，Ｂａ２＋浓度在１０～．１０４ｍｏｌ·Ｌ。１内信号在数秒内可以稳定。１．２微流控芯片在单细胞分析的应用单细胞分析对重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究有重要意义，目前已成为研究的热点之一。由于细胞极小，直径一般为５—５００１．ｔｍ，体积在ｆＬ．ｎＬ，组分含量少（ｆｍ０１．ｚｍ０１）、种类繁多，使得操纵和分析难度很大。因此，要开展单细胞水平的研究，分析方法须具有能处理极小体积（单个全细胞）、同时测定多种化合物，并能给出良好的定性定量的特点。微流控芯片系统在细胞学研究方面有以下的优越性：１．微流控毛细管电泳芯片的通道直径通常在ｔ０．１００ｌａｍ，与单个生物细胞在尺寸上具有相容性；２．微流控毛细管电泳芯片具有网络式二维或三维通道，非常容易操纵单细胞尺度的目标物；３．微流控毛细管电泳芯片为平版式几何构性，更容易进行观察，检测：４．微流控毛细管电泳芯片上有多种操纵细胞的方法；５．微流控毛细管电泳芯片几何尺寸较小，可以用小的电压获得大的电场强度；６．微流控毛细管电泳芯片的传质，传热特别迅速。因此，在微流控芯片上进行细胞研究越来越受到人们的重视。最早在这方面进行研究的是Ｈａｒｒｉｓｏｎ的研究组【２９１。在简单的双．Ｔ通道微芯片上，利用电渗流将细胞从进样通道转移到分离通道，同时可以引入溶膜试剂进行细胞溶膜。当在样品池和废液池间施力Ｈ１００Ｖ电压，当细胞运送至双Ｔ区域，改变各储液池的电压，通道内液流方向改变，从而使细胞由样品通道进入分离检测通道。６青岛科技人学研究生学位论文Ｈｕａｎｇ等【３０，３１】将引入细胞和刺激剂的微通道加工在ＰＤＭＳ盖片上，而定位细胞的微坑则刻蚀在玻璃基片上，以重力流驱动，对单个鼠嗜铬神经癌细胞（ＰＣＩ２）进行传输和定位，通过另一通道导入尼古丁刺激剂，用低噪声碳纤维微电极实时监测了单个ＰＣＩ２细胞神经递质多巴胺的量子释放。Ｆａｎｇ小组【３２】采用十字型毛细管电泳芯片和激光诱导荧光的方法检测了单个人血红细胞中的谷胱肝肽，他们先将细胞用ＮＤＡ进行柱外衍生，利用静压力和一组可操纵的电压控制单个细胞的进样，待细胞贴壁后利用电场使细胞溶膜，然后进行电泳分离和检测。Ａｒａｉｌ等【３３】设计了一种新的分离芯片，可以用于从连续加入的样品溶液中分离目标微生物。Ｊｕｎｃｋｅｒ等ｆ３４】将先前报道的概念进行了组合，利用微观免疫分析和微流控网络来检测ＣＲＰ，蛋白质和其它心脏中的标记物。Ｗａｌｋｅｒ等１３５Ｊ利用微流控系统在微环境中研究了细胞在不同浓度的细菌存在下的感染。Ｔｕｎｇ等【３６】利用固体激光器和ＰＩＮ光检测器在微流控管道中进行细胞计数的研究。凌云扬等【３７】利用ＮＤＡ与谷胱甘肽能快速发生衍生反应的特点，实现了微流控芯片上在线衍生并检测胞内组分。姚波等【３８】采用静压力与电渗驱动相结合的方式，以ＴＯ—ＰＲＯ．３为核酸标记荧光染料，在微流控芯片上实现了流式细胞计数和单细胞荧光检测。Ｇｉｌｌｓ等【３９】在微流控芯片上用透明氧化铟钛（ＩＴＯ）实时监测通道内单个嗜铬细胞释放儿茶酚胺。“等【４０】在微流控芯片上填充钙荧光染料，化学刺激芯片上单个心肌细胞，使心肌细胞收缩，用荧光监测细胞中钙流的变化。Ｓｏｐｅｒ研究组【４ｌ】提出用光活化聚碳酸盐（ＰＰＣ）微流控芯片从细胞液中纯化及预富集基因组ＤＮＡ，不用磁珠及磁场，ＤＮＡ的回收率达（８５士５）％。Ｚａｒｅ研究组【４２】在微流控芯片上集成了ｐＬ级化学细胞流动计，该芯片集操纵细胞、引入试剂、溶胞、衍生、电泳分离及ＬＩＦ检测等多种功能为一体。他们操纵单个ＪａｒｋｅｔＴ细胞（直径约１０ｐｍ），在７０ｐＬ池中溶胞（体积稀释约７０倍），用荧光试剂萘二甲醛（ＮＤＡ）衍生，电泳分离，ＬＩＦ检测了６种氨基酸。殷学峰等【４３Ｊ设计了多个深度微流控芯片用于检测单个人心肌细胞中谷胱甘肽（ＧＳＨ）及反应活性氧（ＲＯＳ）。该芯片可对连续进入的细胞进行分析，分析速度为１５个细胞／Ｉｌ。。Ｋｒａｓｓｏｗｓｋａ等［４叼采用电脉冲将单个细胞穿孔，使药物进入细胞，在微流控芯片上进行电泳分离及检测。他们对采用电穿孔控制孔径大小进行了仔细研究。Ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ等【４５】报道在微流控芯片上高通量操纵单细胞进样、快速电溶胞、电泳分离及荧光检测，并将其应用于分子细胞学研究。Ｅｒｉｋｓｓｏｎ等【４６】最近报道了在微流控芯片上结合光钳技术，研究酵母细胞在环境（介质）改变时细胞体积产生的可逆变化。７微流控芯片单细胞分析１．３电化学发光原理与分析应用１．３．１Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋电化学发光机理一些无机物的络合物、簇合物具有电化学发光（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｒｒｆｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）现象，而Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋是研究最多和应用较广泛的化合物［图１—１】。这是因为Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋化学性质稳定，可在水溶液中、不需除氧和除杂质、室温条件下发光，而且引发电势值适当、激发态反应活性高、寿命长、发光效率高等特点［４７，４８］，本节重点介绍Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光机理。２＋图１－１Ｒｕ（ｂｐｙ）３１＋结构示意图Ｆｉｇ．１－１ＴｈｅｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆＲｕ（ｂｐｙ）３２＋１９７２年Ｔｏｋｅｌ和Ｂａｒｄ［４９】等首次用电化学方法产生Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的激发态，观察到Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光现象。这些开创性的工作为Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光在分析科学中的应用奠定了基础。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光机理可以解释为【５０】：当Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋与Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋反应时产生激发态的Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＂，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋是水溶液中的稳定物种，在＋１．３Ｖ至．１．３Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）电势范围内分别氧化、还原为Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋和Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋，两者反应生成激发态Ｒｕ（ｂｐｙ）３２ｐ，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊回到基态时发出波长约为６１０ｎｌｎ的橘红色光。机理如下：Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋－ｅ－＊Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ｅ－－－－｝Ｒｕ（ｂｐｙ）３十Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋－－－》Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋”＋１，Ｙ）３＋ｈ一般认为Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋体系的发光是因为金属到配体三重电荷传递态青岛科技大学研究生学位论文（ｍｅｔａｌ－ｌｉｇａｎｄｃｈａｒｇｅｔｒａｎｓｆｅｒ，ＭＬＣＴ）跃迁回基态产生的，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的最低激发态是ＭＬＣＴ态，ＭＬＣＴ到基态的跃迁较缓慢，因此发光时间较长，强度较高【５¨。在乙腈溶剂中Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋与Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋淬灭发光效率约为５－６％，比在其它体系中要哥５２Ｊ，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋与草酸盐在水溶液中的电化学发光反应发光效率约２％【５３１。当某些还原剂或氧化剂与Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的氧化或还原产物反应时也可产生电化学发光现象，因此可以用Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光反应体系来对这些还原剂或氧化剂进行分析。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在电极上失去一个电子生成Ｒｕ（ｂｐｙ）３”，Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋与强还原剂反应产生激发态Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊并发光的氧化．还原（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）机理可以表示为：Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋－ｅ－＊Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３３十１Ｒｅｄｕｃｔａｎｔ－－－｝Ｒｕ（ｂｐｙ）３十Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋－－－）Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊－－－÷．Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ｈｖ这类还原剂有一般有ＯＨ一、Ｎ２Ｈ４、ＮａＢＩ－１４、草酸盐、脂肪或环胺、氨基酸、ＮＡＤＨ等。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在电极上得到一个电子生成Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋，Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋与强氧化剂反应产生Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊并发光的还原．氧化（Ｒｅｄｕｃｔ．０ｘｉｄａｔｉｏｎ）机理可以表示为：Ｒｕ（ｂｐｙ）３２十＋ｅ－－－＊Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３十＋Ｏｘｉｄａｎｔ－＊Ｒｕ（ｂｐｙ）３’＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋－－－，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＂－－－＊Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ｈ１，目前己知的该类氧化剂只有Ｓ２０８厶，而且该反应体系在分析科学中的应用非常有限。从上面讲到的三联吡啶钌体系的电化学发光机理来看，其电化学发光有许多自身的特点：（１）电化学发光试剂在电极上原位产生，因此可以通过改变电极电势控制化学发光反应，使发光反应的引发、反应过程和速率在更大程度上进行调节和控制；（２）电化学发光试剂在反应过程中循环作用，反应速度快，发光效率高；（３）通过对被测物的电化学控制可获得更多的分析信息；（４）在反应过程中Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋并无实际消耗，可以通过固定化等方法将其制成传感器，可以大大降低试剂的用量；（５）反应形式多样，在有还原剂和强氧化剂的条件下均可能产生电化学发光。９微流控芯片单细胞分析１．３．２电化学发光在分析科学中应用在分析科学中Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光性质主要用于被测物含量的分析，由于Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的ＥＣＬ具有很多优点，成为ＥＣＬ体系在实际分析中应用最多的化合物。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光作为一种检测方法，常用于流动注射分析（ｆｌｏｗｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＥｔＡ），高效液相色谱（ｈｉｇｈＨＰＬＣ）等流动体系１５４１。Ｄｏｎｇ等【５５］在光纤一端集成了透明的Ａｕ网工作电极以及参比电极和对电极，形成ＥＣＬ传感器的体积约１０ｐＬ，该ＥＣＬ传感器简便、灵敏。有关Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ光纤传感器的工作有ＮＡＤＨ传感裂５６ｊ。光纤末端镀层Ａｕ作为电极，涂一层Ｎａｔｉｏｎ膜吸附Ｒｕ（ｂＰＹ）３２＋，ＮＡＤＨ扩散进入Ｎａｔｉｏｎ膜后施加电位引发ＥＣＬ反应，发出的光通过光纤被检测，该传感器具有较宽的线性检测浓度范围。类似的报道还有Ｒｕ（ｂｐｙ）３２椭ａｆｉｏｎＴＥＡ（三乙胺）气相ＥＣＬ传感器，用于检验水产品的新鲜度【８２】。Ｍｏｆｉｔａ等【５８】将２．（２．氨乙基）．１．甲基吡咯，以及Ｎ．（３．氨丙基）吡咯用于脂肪酸的衍生，ＨＰＬＣ分离后用Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ检测其衍生产物。Ｔｓｕｋａｇｏｓｈｉ等【５９Ｊ利用吐根碱、二硫化碳与过渡金属离子形成的络合物与Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋发生ＥＣＬ反应的性质，结合ＨＰＬＣ分别检测了络合平衡体系中吐根碱与金属Ｃｕ络合物的浓度。进而又把该分析方法扩展至Ｃｕ、Ｎｉ、Ｃｏ的混合体系的分析【６０】。Ｗｏｌｔｍａｎ等【６ｌＪ利用Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的荧光特－Ｉ生（Ｌａｂｓ４５４ｒｕｎ，Ｌｅｍ６０７ｎｍ），对多肽类物质进行了定量分析。具体做法是Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在多孔碳电极上氧化成Ｒｕ（ｂｐｙ）３”，Ｒｕ（ｂｐｙ）３”作为一种还原剂与色谱分离出的物质反应，生成Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋，荧光检测Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋。’Ｂｏｂｂｉｔｔ等【６２】提出了另外一种提高Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ检测灵敏度的方法，即将蛋白质（例如抗生物素蛋白）用带有叔氨基团的生物素衍生，检测限为５０ｎＭ。Ｃｏｌｌｉｎｓ等【６３】报道了一种低成本、多通道、高通量的ＥＣＬ生物分析平台。原型设计为在尺寸２５ｍｍｘ６７５ＩＩＩｌＴＩ的平板玻璃上加工出５０个微通道，薄膜电极作为电泳电极合ＥＣＬ引发电极。进样管与分离通道连接，可以大量连续进样。认为有望应用于药物筛选、基因工程以及组合化学研究。Ｃｒｏｏｋｓ小组Ｍ】提出一种新的ＥＣＬ技术，将ＥＣＬ反应与电化学反应耦合，电化学反应未直接参与ＥＣＬ反应，但是由于电化学池是电荷平衡的，所以电化学反应与ＥＣＬ反应是电荷耦合的。这对于不直接参与ＥＣＬ反应的电化学反应提供了～个方便灵敏的的表征手段，扩大了ＥＣＬ检测氧化还原物种的范围。利用双电极或单电极偶极形式实现这种检测方式，他们利用Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ检测了溶液中的苯基。Ｒｉｃｈｔｅｒ等【６５】研究了笨酚、儿茶酚、氢醌、苯醌对Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的淬灭作用。Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ等【６６】利用循环伏安和电化学阻抗技术研究了硼搀杂金刚石电极上１０青岛科技大学研究生学位论文Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ｆｆＰＡ体系的ＥＣＬ行为。发现金刚石电极上Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋；ｒＰＡ体系的ＥＣＬ反应具有长时间的稳定性，其原因在于反应产物在金刚石表面的吸附效应很小。金刚石电极有望成为一种具有宽的ＥＣＬ电势窗和高稳定性的电极材料。Ｍｕｒｒａｙ等１６７ｊ发现纳米金表面涂覆含硫化合物ｍ．（２．巯基丙酰）甘氨酸以及Ｎ，Ｎ．三甲基（十一烷基巯基胺）稳定剂后，对Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ具有淬灭效应。Ｂａｒｄ小组【６８＇６９】利用ｔｕｎｉｎｇ．ｆｏｒｋ扫描探针显微镜、ＥＣＬ、电流（作为电势的函数）检测等方法，考察了Ｒｕ（ｂｐｙ）３（Ｃ１０４）２固态分子ＥＣＬ薄膜（１００衄厚）的充电、传输以及发光行为和乙腈／苯体系中，施加不同电势条件下芳烃氧化产生自由基与ＴＰＡ之间的ＥＣＬ反应。１．４微流控芯片电化学发光技术的研究与应用１．４．１毛细管电泳．电化学发光检测技术电化学发光用于毛细管电泳是近几年才发展起来的一项检测技术，毛细管电泳．电化学发光检测技术在胺类药物、多胺、环境污染物等的检测中有较广泛的应用【７０１。最早报道的工作是Ｅｗｉｎｇ小组【７ｌ】，他们利用ｌｕｍｉｎｏｌＥＣＬ反应用于ＣＥ检测了辛胺、丙胺以及三肽Ｖａｌ．Ｔｙｒ－Ｖａｌ。Ｗａｎｇ等【７２】设计了毛细管电泳Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋电化学发光原位检测池，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋采用柱后加入的方式原位产生，不需要衍生，对多种氨基酸进行了分离检测。Ｄｉｃｋｓｏｎ等【７３】利用ＣＥ．ＥＣＬ体系分离并检测了赖氨酸、脯氨酸及苯丙氨酸。Ｓｈｉ等【『７４】报道了几种改善Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＣＥ．ＥＣＬ的方法。除了直接检测，Ｋａｎｇ等【．７５】最近还报道了将电化学发光与酚类物质淬灭相结合的毛细管电泳间接电化学检测。汪尔康小组【７６】采用ＣＥ．ＥＣＬ技术对临床、药物样品的测定进行了大量的研究。他们将多孔侵蚀接口应用于ＣＥ－ＥＣＬ检测了Ｌ广脯氨酸７＂０，在此基础匕他们又将Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋－Ｚｒ－Ｎａｆｉｏｎ作为固态电化学发光检测器与ＣＥ联用例，并采用ＣＢＥＣＬ检测生物体液中的天门冬氨酸转氨酶和丙胺酸转氨酣驯，他们还利用场放大ＣＥ－ＥＣＬ检测违禁药品吗啡和可卡因嗍，用ＣＦ＿：Ｒｕ（ｂｐｙ）３２．检测脯氨酰氨基酸（二肽）酶以及在糖尿病中的应用【８１】。鞠幌先等【８２】用ＣＥ．ＥＣＬ同时检测尿样中精神治疗的药物阿密曲替林、多虑平和氯丙嗪。１．４．２微流控芯片电化学发光检测技术在ＣＥ．ＥＣＬ技术发展的基础上，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ技术近几年才开始逐渐应用于微流控芯片技术，与微流控芯片电化学检测相比，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ与微流控芯片联用技术的报道非常有限，Ａｒｏｒａ等【８３】首次将电化学发光检测集成到微芯片上，采用悬浮的Ｕ型Ｐｔ电极置于分离通道上，利用电泳分离时通道内的电场提供所微流控芯片单细胞分析需的电位。Ｈｕａｎｇ等‘８４１设计了一种Ｈ型通道的微流控芯片，对流动注射．毛细管电泳分离的样品进行了ＥＣＬ测定。Ｇｒｅｅｎｗａｙ［８５１在微流控芯片平台上利用Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＥＣＬ反应检测了可卡因、阿托品、哌鱼替啶。汪尔康等【８６１首次将ＩＴＯ电极材料用于芯片的毛细管电泳，组成了集成电化学发光电极的微流控芯片系统。１．５微流控芯片电化学发光技术展望目前，微流控芯片正处于蓬勃发展的时期，人们正不断致力于更加集成化、微型化的微流控分析系统的研究。而ＥＣＬ方法在药物分析、免疫分析和ＤＮＡ探针分析中的应用说明ＥＣＬ方法是一种非常有前景的检测技术。而这两种分析技术结合将会在医药、化学、环境及单细胞分析等诸多领域拥有广阔的应用前景。１２青岛科技大学研究生学位论文参考文献ＭａｎｚＡ．，ＨａｒｒｉｓｏｎＤ．Ｊ．，ＶｅｒｐｏｏｒｔｃＥ．，ｅｔ．ａｌ，Ｐｌａｎａｒｃｈｉｐｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｍｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｔｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ：ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｎａｃｈｉｐ［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９２，５９３：２５３—２５８【２】ＭａｎｚＡ．，ＦｅｔｔｉｎｇｅｒＪ．Ｃ．，ＶｅｒｐｏｏｒｔｅＥ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇｏｆｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｓｉｌｉｃｏｎａｎｄｇｌａｓｓｆｏｒｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］，ＴｒｅｎｄｓＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９１，１０：１４４—１４９ｓｙｓｔｅｍｓ：ａｎｏｖｅｌｃｏｎｃｅｐｔｆｏｒ【３］ＭａｎｚＡ．，ＧｒａｂｅｒＮ．，ＷｉｄｍｅｒＨ．Ｍ．，Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｏｒｓ［Ｊ］，Ｓｅｎｓ，Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，１９９０，Ｂｌ：２４４—２４８【４】ＲｅｙｅｓＤ．Ｒ．，ＰｉｅｒｒｅＡ．Ａ．，ＤｉｍｉｔｒｉａｎｄＩ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｏｒｙ，ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００２，７４：２６２３－２６３６ｏｎ［５】ＹａｎＨ．，ＺｈａｎｇＢ．Ｙ．，ＷｕＨ．Ｋ，ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓａｎｄＭｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｃｙｔｏｍｅｔｒｙｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．，２００８，２９：１７７５－１７８６ＭａｔｙｓｉｋＦ．Ｍ．，Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｃｈｉｐ—ｂａｓｅｄａｎｄｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，ＭｉｃｒｏｃｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，２００８，１６０：１４３６—５０７３ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓａｎｄｔｈｅｉｒ【７】ＨｊｅｒｔｅｎＳ．，Ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｉｎｔｅｒｐｌａｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｏｒｙａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌ１９９０，ｌｌ：６６５－６６９ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，【８】［９】【１０】陈义著，毛细管电泳技术及应用［Ｍ］，化学工业出版社，２０００林炳承著，毛细管电泳导论［Ｍ］，科学出版社，１９９６ＪａｃｏｂｓｏｎＳ．Ｃ．，ＥｒｍａｋｏｖＳ．Ｖ，ＲａｍｓｅｙＪ．Ｍ．，Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｏｌｔａｇｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｆｌｕｉｄｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｖａｌｖｉｎｇｉｎｒｎｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ３２７３．３２７６ｄｅｖｉｃｅｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，７１：ＷｏｏｌｌｅｙＡ．Ｔ．，ＬａｏＫ，ＧｌａｚｅｒＡ．Ｎ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｃｈｉｐｓｗｉｔｈｉｎｔｅｇｒａｔｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９８，７０：６８４－６８８［１２】ＢｒａｚｉｌｌＳ．Ａ．，ＫｉｍＰ．Ｈ．，ＫｕｈｒＷＧ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｓｉｎｕｓｏｉｄａｌｖｏｌｔａｍｍ－Ｃｈｅｍ．，２００１，７３：ｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ａｓｔｒａｔｅｇｙｔＯａｌｌｏｗｆｏｕｒ‘‘ｃｏｌｏｒ＇’ＤＮＡ４８８２－４８９０ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］，Ａｎａｌ［１３】Ｋｌｅｔｔ０．，ＮｙｈｏｌｍＬ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅｆｉｅｌｄｄｒｉｖｅｎｏｎ－ｃｈｉｐａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００３，７５：１２４５—１２５０【１４】ＫｅｙｎｔｏｎＲ．Ｓ．，ＲｏｕｓｓｅｌＴ．Ｊ．，ＣｒａｉｎＭ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，ＤｅｓｉｇｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｄｅｖｉｃｅｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ａｎａｌｙｔｉｃａ２００４，５０７：９５－１０５［１５】ＧａｗｒｏｎＡ．Ｊ．，ＭａｒｔｉｎＲ．Ｓ．，ＬｕｎｔｅＳ．Ｍ．，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｃａｒｂｏｎ—ｂａｓｅｄ１３微流控芯片单细胞分析ｄｕａｌ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｄｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｃｈｉｐｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００１，２２：２４２－２４８【１６】ＭａｒｔｉｎＲ．Ｓ．，ＧａｗｒｏｎＡ．Ｊ．，ＦｏｇａｒｔｙＢ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃａｒｂｏｎｐａｓｔｅ—ｂａｓｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒｓｆｏｒｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２７７．２８０ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］，ＴｈｅＡｎａｌｙｓｔ，２００１，１２６：［１７】ＣｈｅｎｇＸ．，ＺｈａｎｇＳ．，ＦａｎｇＹ．Ｚ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｔａｚｏｎｅｎａｎｏ－ｎｉｃｋｅｌｏｘｉｄｅｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂｏｎｐａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ．【Ｊ】，ＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００８，１０６：８３０—８３８［１８】ＤｏｎｇａｃｉｄＳ．Ｑ．，ＺｈａｎｇＳ，ＦａｎｇＹ．Ｚ．，ｅｔ．ａｌ，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｇａｒｓａｎｄａｓｃｏｒｂｉｃｚｏｎｅｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｍａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｔａｃａｒｂｏｎｐａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ３２７．３３３ａｎｄＣｕ２０［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｔ：．Ａ，２００７，Ｉ１６１：［１９】ＭａｒｔｉｎＲ。Ｓ．，ＲａｔｚｌａｆｆＫ．Ｌ．，ｎｕｙｎｈ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ，Ｉｒｒｃｈａｎｎｅｌｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒａｎｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｕｓｉｎｇ２００２，７４：１１３６．１１４３ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，［２０］ＯｓｂｏｕｒｎＤ．Ｍ．，ＬｕｎｔｅＣ．Ｅ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｃｅｔａｔｅｄｅｃｏｕｐｌｅｒｆｏｒｏｎ—ｃｏｌｕｍｎＣｈｅｍ．，２００１，７３：５９６１—５９６４ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ【２１】ＳｉａｎｇｐｒｏｈＷ．，ＣｈａｉｌａｐａｋｕｌＯ．，ＬａｏｃｈａｒｏｅｎｓｕｋｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｔａｃａｐｉｌｌａｒｙｃｏｂａｌｔｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｈｙｄｒａｚｉｎｅｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，Ｔａｌａｎｔａ，２００５，６７：９０３－９０７【２２】ＷａｎｇＪ．，ＣｈｅｎＣｔ，ＣｈａｔｒａｔｈｉＭ．Ｐ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｉｃｒｏｃｈｉｐｗｉｔｈａｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００４，７６：２９８—３０２［２３】ＧｒａｓｓＢ．，ＮｅｙｅｒＡ．，ＪｏｎｃｋＭ．，ｅｔ．ａｌ，ＡｎｅｗＰＭＭＡ－ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｄｅｖｉｃｅｆｏｒｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，Ｓｅｎｓ．ＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ，２００１，７２：２４９－２５８ｏｎａ［２４】ＫａｎｉａｎｓｋｙＤ．，ＭａｓａｒＭ．，ＢｉｅｌｃｉｋｏｖａＪ．，ｅｔ．ａｌ，ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＰｌａｎａｒＣｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅＣｏｌｕｍｎ—ＣｏｕｐｌｉｎｇＣｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣａｎｎｅｌｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２０００，７２：３５９６·３６０４［２５】ＧａｌｌｏｗａｙＳ．，ＳｔｒｙｊｅｗｓｋｉＳ．，ＨｅｎｒｙＷ：，ｅｔ．ａｌ，Ｃｏｎｔａｃｔｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌｏｆｍｏｎｏ－ａｎｄｐｏｌｙａｎｉｏｎｉｃｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）－ｂａｓｅｄＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｄｅｖｉｃｅｓｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｍｏｌｅｃｕｌｅｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００２，７４：２４０７－２４１５［２６］ＴａｎｙａｎｙｉｗａＪ．，ＨａｕｓｅｒＰ．Ｃ．，Ｈｉｇｈ－ｖｏｌｔａｇｅｃａｐａｃｉｔｉｖｅｌｙｃｏｕｐｌｅｄｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４：６３７８—６３８２【２７］Ｗａｎｇ，Ｊ．，ＣｈｅｎＧ，ＭｕｃｋＡ．，Ｍｏｖａｂｌｅｃｏｎｔａｃｔｌｅｓｓ－ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒｍｉｃｒｏｃｈｉｐ１４青岛科技大学研究生学位论文ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５：４４７５－４４７９【２８】ＴａｎｔｒａＲ．，ＭａｎｚＡ．，ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃＡｎａｌ，Ｃｈｅｍ．，．２０００，７２：２８７５—２８７８ｄｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒｕｓｅｉｎｃｈｉｐ－ｂａｓｅｄｆｌｏｗｃｅｌｌｓ［Ｊ］．【２９】ＧａｖｉｎＰ．Ｅ，ＥｗｉｎｇＡ，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｒｒａｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓＣｈａｎｎｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓｉｎＭｉｃｒｏｍｅｔｅｒａｎｄＳｕｂｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒＣｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ】，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６９：３８３８—３８４５．【３０】ＷａｎｇＪ．，ＴｉａｎＢ．，ＳａｈｌｉｎＥ．，ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＣｈｉｐｓ／ＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＳｐｕＲｅｒｅｄＧｏｌｄＷｏｒｋｉｎｇＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓ【Ｊ］，Ａｎａｌ，Ｃｈｅｍ．，１９９９，７１：３９０１－３９０４［３ｌ】ＷａｎｇＪ．，ＴｉａｎＢ．，ＳａｈｌｉｎＥ．，ＭｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＣｈｉｐｓｗｉｔｈＴｈｉｃｋ－ＦｉｌｍＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，７１：５４３６—５４４０【３２】ＣｈｅｎＤ．Ｃ．，ＨｓｕＥＬ．，ＺｈａｎＤ．Ｚ．，ｃｔ．ａｌ，ＰａｌｌａｄｉｕｍＦｉｌｍＤｅｃｏｕｐｌｅｒｆｏｒＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＣｈｉｐｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，７３：７５８—７６２［３３】ＡｒａｉＥ，ＳａｋａｍｉＴ．Ｉ．Ａ．，ＰｕｋｕｏｄａＴ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｄｅｓｉｇｎａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｅｆｒｏｍｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｓａｍｐｌｅｌｉｑｕｉｄｆｌｏｗｕｓｉｎｇｏｐｔｉｃａｌ２６８．２７４ｔｗｅｅｚｅｒｓ［Ｊ］，ｓｙｓ．Ｍａｎｕ．，２００４，４７：［３４】ＪｕｎｃｋｅｒＤ．，ＭｉｃｈｅｌＢ．，ＨｕｎｚｉｋｅｒＰ．，ｅｔ．ａｌ，ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｐｌａｓｍａｕｓｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣ－ｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｎｄｏｔｈｅｒｃａｒｄｉａｃｍａｒｋｅｒｓｉｎｈｕｍａｎｍｉｃｒｏｍｏｓａｉｃｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ１９３—１２０２ｓｅｌｆ－ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］，Ｂｉｏｒｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃ．，２００４，１９：１Ｍ．，Ｓｕｒｆａｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎ［３５】ＢｅｌｄｅｒＤ．，Ｌｕｄｗｉｇｍｉｃｒｏｃｈｉｐｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３，２４：３５９５－３６０６［３６】ＴｕｎｇＹ．Ｃ．，ＺｈａｎｇＭ．Ｌ．，ＫｕｒａｂａｙａｓｈｉＫ，ｅｔ．ａｌ，ＰＤＭＳ—ｂａｓｅｄｏｐｔｏ—ｆｌｕｉｄｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙｍｉｃｒｏｆｌｏｗＰＩＮｃｙｔｏｍｅｔｅｒｗｉｔｈｔｗｏ··ｃｏｌｏｒ，ｍｕｌｔｉ－·ａｎｇｌｅｕｓｉｎｇｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅｓ［Ｊ］，Ｓｅｎｓ．ＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ，２００４，９８：３５６－３６７【３７】凌云扬，微流控芯片ＮＤＡ在线衍生测定单细胞中谷胱甘肽［Ｊ】，高等学校化学学报，２００５，２６（２）：２４７－２４９［３８】姚波，微流控芯片系统流式细胞术及单细胞荧光检测［Ｊ】，高等学校化学学报，２００５，２６（１）：４３－４５【３９】ＳｕｎＸ．Ｈ，ＧｉｌｌｉｓＩＣＤ．Ｏｎ－ＣｈｉｐＡｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＱｕａｎｔａｌＣａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅＲｅｌｅａｓｅｕｓｉｎｇＴｒａｎｓｐａｒｅｎｔ２５２１－２５２５ＩｎｄｉｕｍＴｉｎＯｘｉｄｅＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ，Ｃｈｅｍ．，２００６，７８：［４０】“Ｘ．Ｊ．，ＬｉＥＣ．，ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＯｎ－ＣｈｉｐＤｙｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｔｅｎｔｉｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｏｆａＳｉｎｇｌｅＣａｒｄｉａｃＭｙｏｃｙｔｅ，Ｌｏａｄｉｎｇ，ＣｅｌｌＣｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｂｙＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａｌｃｉｕｍ［Ｊ］，Ａｎａｌ，Ｃｈｅｍ．，２００５，７７：４３１５－４３２２１５微流控芯片单细胞分析［４１】ＷｉｔｅｋＭ．Ａ．，ＬｌｏｐｉｓＳ．Ｄ．，ＷｈｅａｔｌｅｙＡ．，ｅｔ．ａｌ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｗｈｏｌｅｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｓｕｓｉｎｇｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ（ＰＰＣ）ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｓ［Ｊ］，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｅｉｄ．Ｒｅｓ．，２００６，３４：ｅ７４【４２］ＷｕＨ．Ｋ，ＷｈｅｅｌｅｒＡ．，ＺａｒｅＲ．Ｎ．，Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅＣ６ｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅ［Ｊ］，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬＵＳＡ．，２００４，１０１：１２８０９—１２８１５［４３】ＳｕｎＹ，ＹｉｎＸ．Ｅ，Ｎｏｖｅｌｍｕｌｔｉ－ｄｅｐｔｈｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐｆｏｒｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＡ，２００６，１１７：２２８—２３３【４４］ＫｒａｓｓｏｗｓｋａＷ．，ＦｎｅｖＰ．Ｏ．，Ｍｏｄｅｌｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｉｎ４０４－４１７ａｓｉｎｇｌｅｃｅＨ［Ｊ］，Ｂｉｏｐｈｙｓ五２００７，９２：［４５】ＣｕｌｂｅｒｔｓｏｎＣ．Ｔ．，ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓａｎｄＭｉｎｉａｔｕｒｉｚａｔｉｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｃｙｔｏｍｅｔｒｙｃｈｉｐｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００８，２９：１【４６］Ｅｒｉｋｓｓｏｎ７７５—１７８６ｏｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈＥ．，ＥｎｇｅｒＪ．，ＮｏｒｄｌａｎｄｅｒＢ．，ｅｔ．ａｌ，Ａｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｏｐｔｉｃａｌｔｗｅｅｚｅｒｓｆｏｒｕｐｏｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｚｉｎｇｒａｐｉｄａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｓｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］，Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ．，２００７，７：７１－７６【４７】ＫｎｉｇｈｔＡ．Ｗ．，Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｒｅｃｅｎｔｔｒｅｎｄｓｉｎａｎａｌｙｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］，Ｔｒ．ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，１８：４７－６２［４８】ＬｅｅＷ．Ｙ．，Ｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］，Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，１２７：１９－３９．Ａ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ［４９】ＴｏｋｅｌＮ．Ｅ．，ＢａｒｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩＸ：Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｅｍｉｓｓｉｏｎｆｒｏｍｓｙｓｔｅｍｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ｊ］，ＺＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７２，９４：２８６２－２８６３【５０】ＹｉＩｌｏｆＸ．Ｂ．，ＤｏｎｇＳ．Ｊ．，ＷａｎｇＥ．ｋ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍａｎｄＲ．Ｄ．，Ｂａｒｎｅｔｔａｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］，Ｔｒ．ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００４，２３：４３２－４４１ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ［５１】ＧｅｒａｒｄｉＮ．Ｗ．，ＬｅｗｉｓＳ．Ｗ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）·ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（１１１）ａｓｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｒｅａｇｅｎｔ［Ｊ］，ＡｎａＬＣｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９９，３７６：１－４１［５２】Ｔｏｋｅｌ．ＴａｋｖｏｒｙａｎＮ．Ｅ．，ＨｅｍｉｎｇｗａｙＸＩＩＩ：ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＲ．Ｅ．，ＢａｒｄＡ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｅｅｎｃｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｒｕｔｈｅｎｉｎｍｃｈｅｌａｔｅｓ［Ｊ］，ＺＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７３，９５：６５８２—６５８９［５３】ＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎＩ．，ＢａｒｄＡ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．３７．ＡｑｕｅｏｕｓｂａｓｅｄｏｎＥＣＬｓｙｓｔｅｍＲｕ（２。２’．ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）３２＋ｏｘａｌａｔｅｏｒｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓ［Ｊ］，ＺＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３：５１２．５１６［５４】ＦｉｉｈｎｒｉｃｈＩＣＡ．，ＰｒａｖｄａＭ．，ＧｕｉｌｂａｕｌｔＧ．Ｇ．，Ｒｅｃｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］，Ｔａｌａｎｔａ，２００１，５４：５３１－５５９１６青岛科技大学研究生学位论文［５５】ＷａｎｇＨ．，ＸｕＧ．，Ｄｏｎｇ，Ｓ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｏｐｔｏｐｒｏｂｅｗｉｔｈｍｉｎｉ－ｇｒｉｄｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｎｄｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｅｄｓａｍｐｌｅｃｏｎｔａｉｎｅｒ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，４，２１４．２１７［５６】ＪｉｎＥ．Ｓ．，ＮｏｒｒｉｓＢ。ＪＰａｎｔａｎｏＰ．，ＡｎｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇｆｉｂｅｒｅｌｅｃｔｒｏｄｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｏｒｆｏｒＮＡＤＨ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２００１，１３：１２８７·１２９０［５７】ＥｇａｓｈｉｒａＮ．，ＫｕｍａｓａｋｏＨ．，Ｕｄａ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ，ＦａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆａｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｇａｓｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆＲｕ（ｂｐｙ）３２＋／ｎａｔｉｏｎｇｅｌａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｆｒｅｓｈｎｅｓｓｓｅｎｓｏｒｆｏｒｓｅａｆｏｏｄ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２００２，１４：８７１—８７３［５８】ＭｏｒｉｔａＨ．，ＫｏｎｉｓｈｉＭ．，ＥｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｓａｎｄａｍｉｎｅｓｉｎｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｕｓｉｎｇｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００２，７４：１５８４－１５８９［５９】ＴｓｕｋａｇｏｓｈｉＫ，ＭｉｙａｍｏｔｏＫ，ＮａｋａｊｉｍａＲ．，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｉｏｎｓｂｙｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｔｒｉｓ（２，２＇－ｂｉｐｙｆｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００１，９１９：３３１－３３７［６０】ＴｓｕｋａｇｏｓｈｉＫ，ＯｋｕｚｏｎｏＮ．，ＮａｋａｊｉｍａＲ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｅｍｅｔｉｎｅｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅｍｅｔａｌｃｏｍｐｌｅｘｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｒｉｓ（２，２＇－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）－ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ［Ｊ］，／Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００２，９５８：２８３－２８９［６１】ＷｏｌｔｍａｎＳ．Ｊ．，ＥｖｅｎＷ．Ｒ．，ＷｅｂｅｒＳ．Ｇ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｔｒｉｓ（２．２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ｉｉｉ）ａｓａｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅａｇｅｎｔ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，７１：１５０４—１５１２【６２】ＷａｇｕｅｓｐａｃｋＢ．Ｌ．，ＬｉｌｌｑｕｉｓｔＡ．，ＴｏｗｎｌｅｙＪ．Ｃ．，ｅｔ．ａｌ，ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｔｅｒｔｉａｒｙａｍｉｎｅｌａｂｅｌｉｎｇｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｕｓｉｎｇＲｕ（ｂｐｙ）３２＋－ｂａｓｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｉｍ．，Ａｃｔａ，２００１，４４１：２３１—２４１［６３】ＹａｎＫＹ．，ＳｍｉｔｈＲ．Ｌ．，ＣｏｌｌｉｎｓＳ．Ｄ．，Ｆｌｕｉｄｉｃｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌａｒｒａｙｓｆｏｒｔｈｅｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏａｎａｌｙｔｅｓｕｓｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２０００，２：２２１．２２９［６４】ＺｈａｎＷ．，ＡｌｖａｒｅｚＪ．，ＣｒｏｏｋｓＲ．Ｍ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｅｎｓｉｎｇｉｎｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｓｕｓｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｓａｐｈｏｔｏｎｉｃｒｅｐｏｒｔｅｒｏｆｒｅｄｏｘｒｅａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４：１３２６５—１３２７０【６５】ＭｃＣａｌｌＪ．，ＡｌｅｘａｎｄｅｒＣ．，ＲｉｃｈｔｅｒＭ．Ｍ．，Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｂｙｐｈｅｎｏｌｓ，ｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅｓ，ｃａｔｅｃｈｏｌｓ，ａｎｄｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，７１：２５２３．２５２７Ｋ，ＹｏｓｈｉｍｕｒａＭ．，ＲａｏＴ．Ｎ．，ｅｔ．ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｔｈｅ１７［６６】Ｈｏｎｄａ微流控芯片单细胞分析ｒｕｔｈｅｎｉｕｍｔｒｉｓ（２，２’）ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ／ａｍｉｎｅｓ’ｓｙｓｔｅｍＰｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２００３，１０７：１６５３－１６６３ｏｎａｂｏｒｏｎ－ｄｏｐｅｄｄｉａｍｏｎｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，Ｚ［６７］ＨｕａｎｇＴ．，ＭｕｒｒａｙＲ．Ｗ．，ＱｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆＲｕ（ｂｐｙ）ａ２十ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂｙｂｉｎｄｉｎｇｔｏＡｕｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００２，１８：７０７７－７０８１［６８】ＦａｎＦ．Ｆ．，ＢａｒｄＡ．．．，ＪＳｃａｎｎｉｎｇｏｎｐｒｏｂｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｓｔｕｄｉｅｓｏｆｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅｍｏｌｅｃｕｌａｒＰｈｙｓ．ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｄｅｖｉｃｅｓｂａｓｅｄＣｈｅｍ．Ｅ２００３，１０７：１７８１—１７８７ｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ｉｉ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ［Ｊ］，Ｊ【６９】ＬａｉＲ．Ｙ．，ＢａｒｄＡ。ＪＥｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．７０．ｍａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｅｅｌｔＯｄｅｔｅｒｍｉｎｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｏｆｔｒｉ－ｎ－ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ，ｉｔｓｒａｄｉｃａｌｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｉｎｍｅｃｎ／ｂｅｎｚｅｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］，Ｚｅｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ａ，２００３，１０７：３３３５—３３４０ｗｉｔｈｅｌｅｃｒｔｏｃｈｅｍｉｌｕｎｒｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［７０】ＹｉｎＸ．Ｂ．，ＷａｎｇＥ．Ｋ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓｃｏｕｐｌｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ａｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｉｍ．Ａｃｔａ，２００５，５３３，ｌ１３－１２０【７１】Ｇｉｌｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ＳｉｌｖｅｒｍａｎｆｏｒｃａｐｉｌｌａｒｙＣ．Ｅ．，Ｅｗｉｎｇ，Ａ．Ｇ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，ＪＭｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎＳｅｐ．，１９９４，６：９７—１０６ＢｏｂｂｉｔｔＤ．Ｒ．Ｉｎｓｉｔｕｃｅｌｌｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｇｅｎｅｒａｔｅｄｄｅｔｅｃｉｔｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＡｎａＬ［７２】ＷａｎｇＪ．ａｎｄＲｕ（ｂｐｙ）’２＋－ｂａｓｅｄＡｃｔａ，１９９９，３８３：ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ２１３．２２０Ｃｈｉｍ［７３】ＤｉｃｋｓｏｎＪ．Ａ．，ＦｅｒｉｒｓＭ．Ｍ．，Ｍｉｌｏｆｓｋｙ，Ｒ．Ｅ．Ｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（１ｉＤａｓａｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｒｅａｇｅｎｔＣｈｒｏｍ．，１９９７，２０：６４３－６４６ｆｏｒｄｅｔｅｃｉｔｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｅｒｓｉＳ，ＨＲＣ－ＪＨｉｇｈＲｅｓ．【７４】ＳｈｉＬ．Ｈ．，ＬｉｕＸ．Ｑ．，ＬｉｔｒａｃｔｉｏｎａｔＨ…Ｊｅｔ．ａｌ，ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＤｅｔｅｃｔｉｏｎＢａｓｅｄＣｅｒａｍｉｃＣａｒｂｏｎｏｎＳｏｌｉｄ－ＰｈａｓｅＴｒｉｓ（２，２谚－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）一ＭｏｄｉｆｉｅｄＥｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，７３３０－７３３４【７５］ＫａｎｇＪ．Ｚ．，ＹｉｎＸ．Ｂ．，ＹａｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒＸ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅｗｉｔｈｑｕｅｎｃｈｉｎｇａｓａｎｉｎｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００５，２６：１７３２—１７３６［７６】ＣａｏＷ．Ｄ．，ＹａｎｇＸ．Ｒ．，ＷａｎｇＥ．Ｋ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｅｓｅｒｐｉｎｅｉｎｕｒｉｎｅｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ１６９．１７４ｗｉｍｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ．２００４，１６：［７７】ＹｉｎＸ．Ｂ．，ＱｉｕＨ．Ｂ．，ＳｕｎＸ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐｏｒｏｕｓｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ３８４６－－３８５０ｅｔｃｈｅｄｊｏｉｎｔ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００４，７６：［７８】ＤｉｎｇＳ．Ｎ．，ＸｕＪ．Ｊ．，ＣｈｅｎＨ．Ｙ．，Ｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）一ｚｉｒｃｏｎｉａ－Ｎａｆｉｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅ１８青岛科技大学研究生学位论文ｆｉｌｍｓａｐｐｌｉｅｄｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｓ［Ｊ】，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００５，２６：１７３７－１７４４【７９】ＬｉＴ．，ＹｕａｎＪ．Ｐ．，ＹｉＩｌＪ．Ｙ．，ｅｔ，ａｌ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉ廿１ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｎｄａｌａｎｉｎｅａｎｌｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｂｉｏｆｌｕｉｄｓ［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００６，１１３４：３１１－３１６［８０】ＸｕＹ．Ｈ．，ＧａｏＹ．，ＷｅｉＨ．，ｅｔ．ａｌ，Ｆｉｅｌｄ—ａｍｐｌｉｆｉｅｄｓａｍｐｌｅｔｏｓｔａｃｋｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＯｉｌｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｐｐｌｉｅｄＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，２００６，１１１５：２６０－２６６ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｉｌｌｉｃｉｔｄｒｕｇｓｂａｎｋｎｏｔｅｓ［Ｊ］，［８１】ＹｕａｎＪ．Ｐ．，ＬｉＴ．，ＹｉｎＸ．Ｂ．，ｅｔ．ａｌ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｄａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉ吐１ｔｒｉｓ（２．２’－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｅｖａｌｕａｔｅｃｏｌｌａｇｅｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｎｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ［Ｊ］，ＡｎａＬＣｈｅｍ．，２００６，７８：２９３４．２９３８［８２】ＬｉＪ．Ｇ．，ＺｈａｏＦ。ＪＪｕＨ．Ｘ．，ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃｄｒｕｇｓｉｎｈｕｍａｎｕｒｉｎｅｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔａ，２００６，５７５：５７－６１ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｉｍ．［８３】ＡｒｏｒａＡ．Ｊ．，ＥｉｊｋｅｌＣ．Ｔ．，ＭｏｒｆｗＥ．，ｅｔ．ａｌ，Ａｗｉｒｅｌｅｓｓｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒｏｎａａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｉｒｅｃｔａｎｄｉｎｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄｇｌａｓｓｄｅｖｉｃｅ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３：３２８２－３２８８［８４］ＨｕａｎｇＸ…ＪＷａｎｇＳ．Ｌ．ＦａｎｇＺ．Ｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ／Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓａｍｐｌｅｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃ，ｆｉｏｎ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２００２，４５６：１６７—１７５［８５】ＧｒｅｅｎｗｏｏｄＰ．Ａ．，ＭｅｒｒｉｎＣ．，ＭｃＣｒｅｅｄｙＴ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩ．ｔ－ＴＡＳｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｔｒｏｐｉｎｅａｎｄｐｅｔｈｉｄｉｎｅ［Ｊ］，Ｔａｌａｎｔａ，２００２，５６：５３９－５４５［８６】ＱｉｕＨ．Ｂ．，ＹａｎＪ．Ｌ，ＷａｎｇＥ．Ｋ，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈａｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｄｉｕｍｔｉｎｏｘｉｄｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ—ｂａｓｅｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００３，７５·５４３５—５４４０１９微流控芯片单细胞分析第二章毛细管电泳柱前ＮＤＡ衍生电化学检测人血液中的牛磺酸２．１引言牛磺酸（ｔａｕｒｉｎｅ），是人体必需的一种氨基酸，又名牛胆酸、牛胆素，是在１８２７年由Ｔｉｄｍａｎ和Ｇｍｅｌｉｎ从牛的胆汁中分离出来的一种酸，在人体的组织中也有着很高的含量【１】。在１８４６年经研究测定，确定了其组成中含有牛黄，故名牛磺酸、牛胆碱，其结构较为简单：Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２Ｓ０３Ｈ，称为２．氨基乙磺酸（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）。牛磺酸属于非蛋白质氨基酸，以游离形式普遍存在于人体的各个组织中，不但具有氨基酸的最基本功能，同时还具有很多特殊功能。在促进大脑及智力发育方面，牛磺酸起到重要作用，表现为学习、记忆能力的提高【２】。牛磺酸在中枢神经系统的作用除促进脑发育之外，还是一种神经抑制因子，具有很强的抗痉挛作用，也是一种神经调节因子、渗透调节因子及抗氧化刹３１。在肝胆系统中牛磺酸的作用也比较显著，它参与肝脂质代谢，同时可以抵抗肝损伤，临床上用牛磺酸来治疗病毒性肝炎、肝硬变及肝癌病人，取得一定的疗效。传统的牛磺酸的检测方法有酸碱滴定法【４】，荧光法【５１，高效液相色谱法‘６－８１，氨基酸自动分析法１９，１０】，薄层层析法【ｌｌ】等，在这些方法中，存在着操作繁琐、分析时间长、样品用量多、干扰物质影响测定等缺点。毛细管电泳由于具有较高的理论塔板数、分离效率高、分析速度快、样品用量少、运行成本低、预处理简单等优势，已成功地和各种检测技术联用用于各个分析领域【１２＇１３１。毛细管电泳的电化学检测方法中，安培检测方式具有较高的灵敏度、良好的选择性及费用低等特剧１４】。由于牛磺酸自身不具有电化学活性，不能直接进行电化学检测，因此要通过衍生的方法使其生成具有电化学活性的物质。萘．２，３．二甲醛（ＮＤＡ）是常用的衍生剂，它可以在ＣＮ一存在下与牛磺酸生成具有电化学活性的产物。反应方程式如下，ＨＯ＋ＲＮＨ２＋ＮａＣＮ。——·ＨＯＲ＋２Ｈ２０本文采用毛细管电泳柱前ＮＤＡ衍生电化学检测的方法实现了牛磺酸的定量２０青岛科技火学研究生学位论文检测。详细研究了ＮＤＡ衍生条件、缓冲液的ｐＨ值、浓度、检测电势和分离电压等实验参数对电泳分离和安培检测的影响。确定了检测牛磺酸的最佳实验条件，并进行了人血液样品中牛磺酸含量的检测。为检测牛磺酸提供了一种新的方法。２．２实验部分２．２．１实验仪器电化学分析仪（ＣＨＩ８００型，上海辰华仪器公司，上海）；高压电源（９３２３．ＨＶＰＳ型，北京新技术研究所，北京）；三电极体系为自制碳纤维簇微盘电极（工作电极），铂丝电极（辅助电极）和饱和甘汞电极（ＳＣＥ，参比电极）。２．２．２材料与试剂弹性石英毛细管（内径２５ｌａｍ，外径３７５ｌａｍ，河北永年光导纤维厂，河北）；碳纤维（直径６ｌａｍ，山东工业大学碳纤维研究中心，山东）；１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１牛磺酸溶液：准确称取Ｏ．０３１３ｇ牛磺酸（上海惠兴生化试剂有限公司，上海）用水溶解定容于２５ｍＬ容量瓶中，室温保存；１．００ｘ１０之ｍｏｌ·Ｌ。１ＮＤＡ溶液：准确称取０．０１８４ｇＮＤＡ（Ｓｉｇｍａ公司，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，美国）用乙腈溶解定容于１０ｍＬ容量瓶中，室温下避光保存；１．００ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ－１溶液：称取０．００４９用水溶解定容于１０ｍＬ容量瓶中，室温下保存；ｇＮａＣＮ（上海生化试剂公司，上海）１．２５ｘ１０也ｍｏｌ·Ｌ。１硼砂－ＮａＯＨ缓冲液：称取０．０４７７ｇ硼砂（莱阳经济技术开发区精细化工厂，山东）用水溶解定容于１００ｍＬ容量瓶中，然后用０．１ｐＨ值为所需大小；Ｈａｎｋ’Ｓ溶液：称取０．８０１０．００６ｇＫＨ２Ｐ０４，０．０３４ｇｇＮａＣｌ，０．０４ｇＫＣｌ，Ｏ．０１４ｇＣａＣｌ２，０．０３５ｇＮａＨＣ０３，ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ调Ｇｌｕｃｏｓｅ用水溶解定容于１００ｍＬ容量瓶中，室温下避光保存；乙腈，色谱纯，上海生化试剂公司；健康成人抗凝血和非健康成人抗凝血由青岛市肿瘤医院提供。２．２．３实验方法２．２．３．１碳纤维簇微盘工作电极２ｌ微流控芯片单细胞分析参考文献１１５］，整个制作过程如图２．１所示。将一柬碳纤维（直径６ｌａｍ，约３０，．－４０根）的一端沾少许丙酮，插入一段长约３ｃｍ，内径２００ｌａｍ，外径３７５ｌａｍ的石英毛细管中，两端露出碳纤维。再将此碳纤维一端浸入５０２胶中。由于毛细现象，５０２胶沿毛细管向上爬升，充满整个毛细管（图２－１Ａ）。待胶干燥后，将其塞入一段长约３ｃｍ，外径约４ｍｍ，内径约为２．５ｍｍ的玻璃管，用ＧＪ一３０１型环氧树脂胶封住玻璃管与石英毛细管变界处。待胶干燥后，用自制的微量取样器吸取少最的汞｝ｌ＿｜敞口端注入玻璃管，从玻璃管的敞ｕ端插入一根两端新打磨的铜丝（直径０．４ｍｍ，Ｋ４ｃｍ），用铜丝推动汞弓碳纤维良好包容（图２－１１３）。然后用ＧＪ一３０１型环氚树脂胶封住玻璃毛细管的敞Ｌ】端（图２．ＩＣ），把露在外面的碳纤维剪平，再用余相砂纸磨平．使之与毛细管ｍ【］端平齐（图２．ＩＤ）。之后依次在无水乙醇．Ⅱ沸燕馏水ｔｐ用超声波清洗５ｍｉｎ后，即可用于毛细管电泳检测。。—Ｅ＝＝＝＝＝＝卜Ｌｒ——１７’＿＿７■—［—］＿＿ｌ＿卜—－＿／／／．冉＝＝声＝：＝１．．．．．．．．．．．．Ｌ．．．、，‘』·．．：．一６５４图２．１碳纤维簇微盘电极的制作过程示意图Ｆｉｇ２－１Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｃａｒｂｏｎｆｉｂｒｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｍａｎｕｆａｃａｍｎｇｐｒｏｃｅｓｓ１，ｑｕａｒｔｚｃａｐｉｌｌａｒｙ；２，ｃａｒｂｏｎｆｉｂｒｅ；３，５０２ｇｕｍｓ：４，ｇｌａｓｓｔｕｂｅ；５，ｍｅｒｅｕｒｙ；６，ｃｏｐｐｅｒｗｉｒｅ；７，ｔｙｐｅＧＪ·３０１ｗｒｅａｔｈｏｘｙｇｅｎｒｅｓｉｎｇｕｍ２．２３２碳纤维簇微盘电极的处理碳纤维簇微盘电极在使用前在金相砂纸上将端口磨平，依次在无水乙醇，亚沸燕馏水中用超声波清沈５ｍｉｎ后，即可使用。由于每次试验后碳纤维会从溶液中吸附某些物质使电极表面状态发生变化，这些变化将导致电极灵敏度和重现性的改变，所以每次进行屯泳检测ｌｊｌ『都必须对电极进行清洗。实验中发现，用该方法清洗过的电极具有良好的重现性。３线性扫描伏安法２．２３青岛科技大学研究生学位论文分别向微型电解池中移入（１）１液，（２）１安曲线。ｍＬ１．００ｘ１０‘２ｍＬｐＨ１１．０４的８．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－。Ｎａ２８４０７缓冲ｍＬｔｏｏｌ·Ｌ－１牛磺酸溶液和（３）１１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１牛磺酸衍生物溶液，把碳纤维簇微盘工作电极插入溶液中，接通电解池，记录各溶液的循环伏２．２．３．４ＣＥ／柱端安培检测将一次性注射器的针头截去约４ｃｍ金属针头，剩余约１ｃｍ金属管。将毛细管的进样端从此针头的金属管端穿过，并使进样端距金属管约５ｃｍ。然后用石蜡在金属管口的位置将毛细管固定密封，以便于用注射器清洗毛细管。毛细管进样端与高压电源正极一起插入盛有电泳缓冲液的烧杯中。毛细管出口端用石蜡固定在检测电解池上。高压电源负极与此检测池连通。充满电泳缓冲液的毛细管与高压电源形成回路，构成ＣＺＥ的分离系统。用于检测的碳纤维电极被固定于三维显微操纵器上，在显微镜下调整碳纤维电极的位置使之于毛细管的出口端紧密对接。毛细管在每次使用之前依次用Ｏ．１０ｍｏｌ·Ｌ．１ＮａＯＨ及蒸馏水各清洗５ｍｉｎ，然后再将电泳缓冲液充满毛细管。实验过程中，毛细管两端施加一定的分离电压，选定工作电极的检测电势，当毛细管内的电渗流达到恒定值后（约ｌＯ．２０ｍｉｎ后），开始进样并记录电泳图。工作电极电势均相对于饱和甘汞电极（ｓａｔｕｒａｔｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅ，ＳＣＥ）。ｃａｌｏｍｅｌ２．２．３．５牛磺酸衍生方法移取１００ｐＬ１５０ｐＬ１．００ｘ１０。２１．００ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ。１的牛磺酸溶液于１ｍＬ塑料ｅｐｐｅｎｄｏｆ试管中，加入ｐＬｔｏｏｌ·Ｌ。１的ＮａＣＮ水溶液和１００１．００ｘ１０一ｔｏｏｌ·Ｌ－１的ＮＤＡ乙氰溶液，并用ｐＨ１１．０４的８．ＯＯＸ１０一ｔｏｏｌ·Ｌ１ＮａｚＢ４０７缓冲溶液稀释至１ｍＬ，将溶液混合均匀，置于蔽光处反应３０ｍｉｎ后，再经摇匀，即可用于毛细管电泳电化学检测。２．２．３．６溶血样提取液的制备和衍生用微量移液器准确移取２００ｐＬ新鲜抗凝血于１．５ｍＬ塑料ｅｐｐｅｎｄｏｆ试管中，加入５５０ｐＬｐＨ１１．０４的８．００×１０一ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７缓冲溶液混合均匀，室温下将试管放入超声波中超声２０ｍｉｎ使细胞膜破裂，然后分别ｌ句ｅｐｐｅｎｄｏｆ试管中加入１００ｐＬ浓度１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＤＡ溶液和１５０ｌＩＬ浓度１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣＮ溶液得到１．ＯｍＬ混合液，混合均匀进行衍生反应３０ｍｉｎ后，以１５００ｒ·ｍｉｎ‘１离心（半径１５ｃｍ水平转子）１５ｍｉｎ，取出上清液用于毛细管电泳分离检测。微流控芯片单细胞分析２．３结果与讨论２．３．１牛磺酸衍生物的循环伏安特性在ｐＨ１１．０４的８．００Ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ—Ｎａ２８４０７缓冲液中，有ＣＮ。存在下，以ＮＤＡ作为衍生剂可使牛磺酸衍生为稳定的且具有电活性的稳定的络合物。图２．２中曲线ｌ是ｐＨ１１．０４的８．００ｘ１０一ｔｏｏｌ·Ｌ～Ｎａ２８４０７缓冲液的循环伏安曲线；曲线２是在ｐＨ１Ｉ．０４的８．００ｘ１０一ｔｏｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７缓冲液条件下，标准牛磺酸液的循环伏安曲线；曲线３是在ｐＨ１１．０４的８．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７缓冲液条件下，牛磺酸衍生液的循环伏安曲线。∞¨¨ＵＵＵ图２－２牛磺酸的循环伏安曲线图Ｆｉｇ．２－２ＣｕｒｖｅｓｏｆｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙｏｆｔａｕｒｉｎｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１，８．００ｘ１０一ｍ０１．Ｌ－１Ｎａ２８４０７ｐＨ１１．０４；２，（１）＋８．ＯＯｘｌ０～ｔ００１．Ｌ’１ｔａｕｒｉｎｅ；ＮＤＡ；ｓｃａｎｒａｔｅ，１００ｍＶ·ｓ～．３，（２）＋１．５０ｘｌＯ—ｍｏｌ·Ｌ—ＮａＣＮ，１．ＯＯｘｌ０一ｔｏｏｌ—Ｌ由图２．２中的三条曲线可以看出，曲线１与２中都没有阳极峰出现，可知未经衍生的牛磺酸没有电化学活性；曲线３中，出现了明显的阳极峰，可以说明牛磺酸衍生物溶液中存在电化学活性物质。ＣＺＥ／柱端安培检测牛磺酸衍生物的电泳条件的选择２．３．２２．３．２．１衍生反应时间通过实验发现，ＮＤＡ和ＣＮ一与牛磺酸的衍生反应比较稳定，３０产物能长时间有效。ｍｉｎ．１０５ｒａｉｎ之间，每隔１５１１１ｉｎ进样检测，峰电流昂基本不变，故在室温（２５℃）下，该衍生反应２４青岛科技大学研究生学位论文２．３．２．２缓冲溶液ｐＨ的影响在相同浓度不同ｐＨ值的Ｎａ２８４０７缓冲体系中检测牛磺酸衍生物，所得峰电流ｉｐ与ｐＨ值的关系示于图２－３。由图２．３可见，牛磺酸衍生物的峰电流随缓冲液ｐＨ的增大而逐渐增大。当达至ｔＪｐＨ１１．０４时，出现转折，牛磺酸衍生物的峰电流开始随ｐＨ的增大而减小。所以，检测牛磺酸衍生物的最佳缓冲液ｐＨ为１１．０４。９．０９－５１０．０Ｉｏ．５１１．ＯＩＬ５１２０１２ＳｐＨ图２—３缓冲液的ｐＨ值对牛磺酸峰电流ｆｐ的影响Ｆｉｇ．２．３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｕｆｆｅｒｐＨｏｎ‘ｏｆｔａｕｒｉｎｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０一ｍ０１．Ｌ．１ｔａｕｒｉｎｅ＋１．５０×１０。ｍ０１．Ｌ－１ＮａＣＮ＋１．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＤＡ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，２０ｋＶ；ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｏ．９０Ｖ（ＶＳ．ＳＣＥ）；ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，５ｋＶ×１０ｓ；ｃａｐｉｌｌａｒｙ，Ｉ．Ｄ．，２５ｐｍ，Ｏ．Ｄ．，３７５ｐｍ，ｌｅｎｇｔｈ，４０ｃｍ．２．３．２．３缓冲液浓度的影响在不同的缓冲液浓度ＣＢ下，得到牛磺酸衍生物的迁移时间‰和峰电流ｉｐ与ＣＢ的关系曲线示于图２．４。由图２．４可以看出，随着硼砂缓冲液浓度的增加，出峰时间‰逐渐增加，牛磺酸衍生物峰电流毛先增大后减小，在缓冲液浓度为８．００ｘ１０。３ｍｏｌ·Ｌ．１时，有最大值。因此选择牛磺酸衍生物的最佳缓冲液浓度为８．００ｘ１０。３ｍ０１．Ｉ，．１。微流控芯片单细胞分析望毒莹Ｏ５１０１５２０２５Ｏ５ｌＯ１５∞２５ＣＢ／（１０＂３ｍ］ｉ／Ｌ）ｑ３／（１０＂３ｍ３／Ｌ）图２－４缓冲液浓度ｃＢ对ｆｍ和昂的影响Ｆｉｇ．２－４Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｏｎｔｍａｎｄｆｐｏｆｔａｕｒｉｎｅ．ａｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｐＨ１１．０４；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅＦｉｇ．２—３．２．３．２．４分离电压的影响不同分离电压玩下，测定牛磺酸衍生物的迁移时间‰和峰电流ｉｐ与以的二条曲线示于图２．５。由图２．５可见，随圪的增大，‰缩短，／ｐ增大，当圪为２０ｋＶ时，ｆＤ较大，基线噪音较低。而当以为２５ｋＶ和３０ｋＶ时，虽然／ｐ很大，但是基线噪音也比较大，而且由于‰缩短，使各峰出现重叠现象。所以，综合考虑，选择圪为２０ｋＶ。２芒毒§５１０１５２０２５３０搿【ｖ图２－５分离电压圪对‰和ｆｐ的影响Ｆｉｇ．２－５Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ圪ｏｎｔｍａｎｄ／ｐｏｆｔａｕｒｉｎｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－’Ｎａ２８４０７（ｐｎ１１．０４）；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．２—３．２６青岛科技人学研究生学位论文２．３．２．５检测电势的影响在不同检测电势西下，所得牛磺酸衍生物的／ｐ与西的关系示于图２－６，由图２－６可见，牛磺酸衍生物的峰电流／ｐ随检测电势凰的增大而增大，但是，当检测电势超过Ｏ．９０Ｖ时，电泳图的噪音明显增大，并随检测电势的增大而增强。因此，为获得最大灵敏度，实验选择检测电位为Ｏ．９０Ｖ。§ｏ．８ｏ．９１．Ｏ１．１１２Ｅ小图２－６检测电势局对牛磺酸峰电流ｆｐ的影响Ｆｉｇ．２－６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘｏｆ局ｏｎ审ｏｆｔａｕｒｉｎｅ１１０一ｍｏｌ·Ｌ１Ｎａ２８４０７（ｐＨ１．０４）；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．２—３．２．３．２．６牛磺酸的标准电泳图２１００∞Ｏｆｍ／ｓ枷图２．７实验条件下牛磺酸衍生物的标准电泳图Ｆｉｇ．２．７Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ１，ＮＤＡｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ１．５０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ一‘ＮａＣＮ＋１．ＯＯｘｌＯ。３ｍｏｌ·Ｌ１Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘ１０‘３ＮＤＡ；２，（１）＋１．ＯＯｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１１ｔａｕｒｉｎｅ．ａｓｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７（ｐＨ１．０４）；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅＦｉｇ．２—３．２７微流控芯片单细胞分析根据以上数据，确定最佳检测条件为：ｐＨ１１．０４的８．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１Ｎａ２８４０７缓冲溶液，分离电压为２０ｋＶ；检测电势为Ｏ．９０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）。在此条件下，分别将空白ＮＤＡ衍生液和经ＮＤＡ衍生化处理的牛磺酸在５．０ｋＶ下电迁移进样１０Ｓ，得到如图２．７所示的电泳图。图２．７中曲线ｌ为１．５０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ。１ＮａＣＮ和１．００ｘ１０。ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＤＡ混合液的电泳图；曲线２为１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１牛磺酸衍生物的典型电泳图。由曲线ｌ和曲线２可以看出，曲线２中ｌｍ约３４０ｓ时新增加的峰ｐｅａｋ５为牛磺酸衍生物的峰。２．３．２．７牛磺酸衍生物的线性范围、检测限及重现性配制一系列不同浓度的牛磺酸衍生物的标准溶液，在以上优化的条件下，测定不同浓度下的峰电流ｆｐ值，以ｌｇｃ对ｌｇｉｐ作图，示于图２．８，得到了牛磺酸衍生物的线性范围（５．００ｘ１０－６．１．ＯＯｘｌ０一ｍｏｌ·Ｌ－１），线性回归系数为０．９９９７，并以电泳峰电流与噪声比值（Ｓ／Ｎ）为３时得到浓度检测限为１．６０ｘ１０西ｍｏｌ·Ｌ～。在最佳条件下，对１．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１牛磺酸衍生物进行６次平行检测，得至ｌｊｉｐ和‰的相对标准偏差分别为２．５％和１．７％。可说明重现性良好。１．５１．０Ｏ．５’毋０．０－０．５．１．Ｏ．２．５．２．０．１．５－１．０—０．５０．０ｌｇｃ图２．８牛磺酸衍生物的审（Ａ）与ｃ（ｍｏｌ‘Ｌ１）的对数关系图Ｆｉｇ．２－８ＳｔａｎｄａｒｄｗｏｒｋｉｎｇＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘｃｕｒｖｅｏｆｌｇｉｐｔｏＩｇｃｔｈｅｓａｍｅａｓ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７（ｏＨ１１．０４）；ｏｔｈｅｒｓＦｉｇ．２－３．２．３．３人血液样品中牛磺酸的检测２．３．３．１定性与定量在最佳检测条件下，分别将健康成人溶血样和非健康成人溶血样５．０ｋＶ电迁移进样１０ｓ，得到电泳图２－９，经与图２。８曲线２比对可知图２－９曲线１，２中‰约青岛科技大学研究生学位论文３４０ｓ时的ｐｅａｋｌ为牛磺酸衍生物的峰，并测得健康成人溶血样牛磺酸含量为ｍｍ０１．Ｌ－１，非健康成人溶血样牛磺酸的含量为０．２２２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。经研究表０．０６０１５明非健康成人溶血样中牛磺酸含量高于健康成人血样中牛磺酸含量的原因是由于非健康成人淋巴细胞个数多于健康成人淋巴细胞个数所致。ＩＯ．１ｎＡ１∞２００湖４００ｔｍ淹５００图２－９人血液样品的电泳图１．健康成人溶血样：２．非健康成人溶血样．Ｆｉｇ．２－９Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆｈｕｍａｎｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅ１，ｎｏｒｍａｌｈｅｍｏｌｙｓｉｓ；２，ａｂｎｏｒｍａｌｈｅｍｏｌｙｓｉｓ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ．１Ｎａ２８４０７（ｐＨ１１．０４）；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．２．３．２．３．３．２加标回收率的测定最优条件下的回收率试验采用标准加入法，取１．０ｍＬ非健康成人溶血样分别加入１．００ｘｌ０～ｍｏｌ·Ｌ－１的牛磺酸１．ＯｐＬ、２．ＯｐＬ、多．ＯｐＬ，加入衍生试剂进行衍生反应３０ｍｉｎ后，进行毛细管电泳分离检测，加标回收率的结果示于表２．１，可见回收率在９３．９５％之间。说明该方法准确可靠。表２－１加标回收率的测定结果Ｔａｂ．２－ｌＴｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆｔａｕｒｉｎｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：８．００ｘ１０～ｔｏｏｌ－Ｌ～Ｎａ２８４０７（ｐｎｌ１．０４）；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．２－３．２９微流控芯片单细胞分析２．４结论采用了柱前萘．２，３．二甲醛（ＮＤＡ）衍生毛细管电泳的方法测定牛磺酸，经实验测定在ｐＨ１１．０４的８．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２８４０７缓冲溶液中，衍生反应时间３０ｍｉｎ，检测电势为Ｏ．９０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ），分离电压为２０ｋＶ，进样电压为５ｋＶ，进样时间为１０ｓ为最佳条件，在此优化条件下牛磺酸的浓度与峰电流呈良好的线性关系，线性范围为５．００ｘ１０－６１．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ～，线性回归系数为０．９９９７，浓度检出限ＬＯＤｅ为１．６０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ。１（Ｓ／Ｎ＝３），并且重现性良好。用该方法检测人溶血样中牛磺酸的含量，加标回收率在９３．９５％之间。说明毛细管电泳ＮＤＡ柱前衍生电化学检测方法适合检测牛磺酸含量，而且性能优良。３０青岛科技大学研究生学位论文参考文献［１】ＫｎｏｘＪ．Ｈ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｐａｃｋｅｄｔｕｂｅｓｕｓｉｎｇ１．５ｔＯ５０岫ｓｉｌｉｃａｇｅｌｓａｎｄＯＤＳｂｏｎｄｅｄｓｉｌｉｃａｇｅｌｓ［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ，１９８９，２６：３２９－３３１［２】韩晓斌，牛磺酸对人胚大脑神经细胞增值的影响阴，卫生研究，１９９１，２０（５）：２８．３［３】ＴｏｗｎｓＪ．Ｋ，ＲｅｇｎｉｅｒＥＥ．，ＩｍｐａｃｔｏｆＰｏｌｙｃａｔｉｏｎ１ＡｄｓｏｒｐｔｉｏｎｏｎＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄＥｌｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙＤｒｉｖｅｎＴｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９２，６４：２４７３．２４７８［４】中华人民共和国国家标准，食品泐口剂牛磺酸【ｓ】，ＧＢｌ４７５９．１９９３［５】中华人民共和国国家标准，婴幼儿配方食品和乳品牛磺酸的测定ＩＳ］，ＧＢ／Ｔ５４１３．２６－１９９７［６】６汤志刚，周琪荣，段占庭，柱前衍生高效液相色谱法检测合成牛磺酸及其中间产物的含量【Ｊ】，分析化学，１９９９，２７：１０８４．１０８６［７】朱慧，赵志红，施文蓉，应用单磺酰氯柱前衍生法测定食品中的牛磺酸【Ｊ】，宁波高等专科学校学报，２００１，０１：１９．２４［８］王晓菲，罗晓星等，ＲＰ．ＨＰＬＣ法检测海马脑片灌流液中氨基酸类神经递质［Ｊ］，第四军医大学学报，２００２，０５：４５－４７［９】徐建华，邢金川，牛磺酸、羟脯氨酸、色氨酸和鸟氨酸的测定【Ｊ］，预防医学文献信息，２００３．９：６８３－６８４【１０］陈芷荃，王华，食品中牛磺酸检测方法研究【Ｊ］，食品工业，１９９５，０４：３７－４０［１Ｉ】祖如松，食品中牛磺酸的测定方法一薄层层析法［Ｊ】，中国卫生检验杂志，１９９８，８：２９２．２９３【１２］ＬａｎｄｅｒｓＪ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｍ］，ＣＲＣＰｒｅｓｓ：ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ１９９７［１３］ＳｈｉｎＤ．Ｃ．，ＳａｒａｄａＢ．Ｖ．，ＴｒｙｋＤ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉａｍｏｎｄｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｆｏｒｅｎｄ－ｃｏｌｕｍｎｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，７５：５３０．５３４［１４】刘继锋，杨秀荣，汪尔康，毛细管电泳安培检测技术进展［Ｊ］，分析化学，２００２，３０：７４８．７５３【１５】ＪｉｎＷ．Ｒ．，ＷｅｎｇＱ．Ｆ．，ＷｕＪ．Ｒ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅ￥ｅｒｕｌＴｌａｌｂｕｍｉｎｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙａｔｚｏｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ谢ｔｌｌｅｎｄ—ｃｏｌｕｎｍａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ９９７，３４２：６７－７４ｔ１１ｅｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏｄｉｓｋａｒｒａｙｅｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１３１微流控芯片单细胞分析第三章微流控芯片电化学检测系统的研究３．１引言自２０世纪９０年代初ｆｌ－ｔＭａｎｚ等【ｌ】提出以微机加工技术（ＭＥＭＳ）为基础的“微型全分析系统＂（Ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ，ｐＴＡＳ）的概念以来，分析技术的微型化、集成化和自动化一直是分析科学发展的主导趋势。其中微芯片毛细管电泳（ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＭＣＣＥ）作为一种ｐＴＡＳ装置，在生物、临床、医药、工业、环境等一系列领域中得到广泛应用【２’３】。微芯片毛细管电泳（ＭＣＣＥ）是集成化技术和毛细管电泳（ＣＥ）技术结合的产物，与传统毛细管电泳技术相比，具有样品用量更少，分离速度更快的特点，但对检测的灵敏度和响应速度提出了更高的要求。而且灵敏和小型的检测器对于充分展示ＭＣＣＥ的优点极为重要。目前最常用的检测方式为激光诱导荧光（ＵＦ）【４，５Ｊ。ＬＩＦ检测由于需要体积庞大、技术复杂的光学系统的支持，难以适应系统微型化的要求。电化学检测尤其是安培检测具有灵敏度高，选择性好，易于集成微型化等优点，因此将电化学检测应用于微流控芯片毛细管电泳的研究受到愈来愈多的关注。其中柱端检测成为ＭＣＣＥ安培检测的主要方式。Ｗａｌｌｇ等【６Ｊ设计了一种厚膜电极电化学检测器。Ｍａｒｔｉｎ等【７】首次在柱端安培检测方式中使用双工作电极。柱端安培检测下，工作电极和分离通道木端对齐有一定难度，相关工作仅有少数人报掣引，取得了一些进展，但仍需进一步的研究和完善。目前，制作毛细管电泳微芯片的基片材料有单晶硅、无定形硅、普通玻璃、优质石英和有机高聚物，如环氧树酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷【９。１４】等。聚二甲基硅氧烷（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ，ＰＤＭＳ）作为一种材料。具有廉价、柔韧性好和透光性好等优点。ＰＤＭＳ透气、不透水、对细胞无毒害作用，因此具有良好的生物兼容性【ｌ５１。近来ＰＤＭＳ在微流控芯片领域得到较多应用【ｌ６１。本文以ＰＤＭＳ做为芯片制作材料，设计研制了基于碳纤维簇微盘电极的集成芯片毛细管电泳电化学检测器，该检测装置可方便、快速、准确地实现工作电极与分离通道出口的对准，大大提高了芯片毛细管电泳安培检测体系的微型化、集成化程度。同时可以方便的更换电极，根据需要选用各种微电极或修饰电极，便于电极的再生。且整个系统的分析性能重现性好，适用面广。３２青岛科技大学研究生学位论文３．２实验部分３．２．１仪器ＰＤＭＳ芯片（购白大连化学物理研究所）；ＭＰＩ．Ｍ型微流控芯片化学发光分析系统电化学分析仪、ＭＰＩ．Ｍ型微流控芯片化学发光分析系统数控多路高压电源（西安瑞迈分析仪器有限公司，西安）。高压电源输出为４路，每路输出电压量程为０．２０００Ｖ。电热鼓风干燥箱（１０１．０ＡＢ，天津市泰斯特仪器有限公司，天津）；超声波清洗器（ＫＱ一５００Ｂ，昆山市超声仪器有限公司，昆山，江苏）；ｐＨ计（ＰＨＳ．２５，上海精密科学仪器有限公司，上海）；循环水真空泵（ＳＨＺ．Ｄｉｌｌ，巩义市予华仪器有限公司，菏泽）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，北京）；显微镜（ＸＳＰ．８ＣＡ，上海永亨光学仪器制造有限公司，上海）；隔膜真空泵（天津市津腾设备有限公司，天津）；手电钻（ＴＣＴ－２２１０，上海牧东实业有限公司，上海）。３．２．２材料与试剂材料：弹性石英毛细管（内径２５０ｌａｍ，外径３７５ｌａｍ，河北永年光导纤维厂）；碳纤维（直径６１ａｍ，山东工业大学碳纤维研究中心）；８号针头；７号针头（标准：ＹＹ／Ｔ０２８２．１９９５，武汉市王冠医疗器械有限公司）试剂：所有试剂均为分析纯。稀释和配制溶液均使用二次过滤水配制。所有玻璃容器在使用前都清洗干净并用二次水冲洗干净，待用。０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液：称取４ｇＮａＯＨ（烟台三和化学试剂有限公司，ＡＲ）溶于水中，定容至１０００ｍＬ容量瓶中。使用前用Ｏ．２２ｌａｍ孔径的过滤器过滤。１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液：称取４ｇＮａＯＨ（烟台三和化学试剂有限公司，ＡＲ）溶于水中，定容至１００ｍＬ容量瓶中。Ｏ．０１ｍｏｌ·Ｌ．１硼酸缓冲溶液：称取Ｏ．１５４６ｇ硼酸（烟台三和化学试剂有限公司，ｍｏｌ·Ｌ．１ＡＲ）溶于水中，定容至２５０ｍＬ容量瓶中，用ｌ使用前用０．２２ｌａｍ孔径的过滤器过滤。０．０１ＮａＯＨ溶液调至所需ｐＨ值。ｍｏｌ·Ｌ－１抗坏血酸溶液：准确称取０．０４４０ｇ抗坏血酸（纯度＞９９．７％，天津市博迪化工有限公司）溶解于１０ｍＬ小烧杯中，定容至２５ｍＬ容量瓶中。使用时用缓冲溶液稀释至１０ｍＬ容量瓶中，并用Ｏ．２２ｌａｍ孔径的过滤器过滤。０．００５ｍｏｌ·Ｌ－１铁．Ｏ．２０ｍｏｌ·Ｌ－１氯化钾溶液：称取０．１３３１２５ｇＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（天津市微流控芯片单细胞分析瑞金特化学品有限公司，ＡＲ），１．４９口瓶中，待用。ｇＫＣＩ溶解定容至１００ｍＬ容量瓶中，放入棕色广３．２．３实验方法３．２．３．１电化学检测池的制作微流控芯片柱端安培检测所用的三电极检测池外型如图３．１所示，模板所用的材料是有机玻璃板１，在长３．０ｃｍ，宽２．２ｃｍ，厚度６ｉｌｌｒｆｌ的有机玻璃板一侧的位置用电钻打孔作为检测池２（孔径Ｏ．５ｅｍ），在如图３．１所示３和４的位置上钻孔分别插入两根外径５００ｐｍ，长约１．５ｃｍ的铂丝用作高压负极和辅助电极，铂丝的末端用手工圈制成铂丝圈，平铺在检测池１的底部。将自制的Ａｇ／ＡｇＣＩ参比电极用微型定位装置固定在距离工作电极３００ｐｍ处。将一根一次性注射器（５ｍＥ）的７号钢管针头（夕｝、径６８０ｐｍ，内径３８５ｐｍ，长２．５ｅｍ）用ＡＢ胶固定在如图３．１所示５的位置上作引导管，用来固定自制的碳纤维簇微盘工作电极，使用时，将电极插入到引导管中，在显微镜的视野下观察使之与微流控芯片的出口端对齐，即可用于微流控芯片柱端安培检测。图３－１三电极检测池１．有机玻璃板；２．检测池；３．辅助电极；４．高压负极；５．引导管；６．Ａｇ／ＡｇＣｌ参比电极Ｆｉｇ．３－１ｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｏｆｔｈｒｅｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ１，ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓｂｌｏｃｋ；２，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；３，ａｓｓｉｓｔａｎｔｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；４，ｃａｔｈｏｄｅｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ；５，ｇｕｉｄｅｔｕｂｅ；６，Ａｇ／ＡｇＣｌｗｉｒｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ３．２．３．２ＰＤＭＳ芯片的构造芯片结构如图３．２所示：ａ．缓冲液池；ｂ．样品池；ｃ．样品废液池。芯片面积６．２ｃｍｘ１．５ｃｍ，通道截面近似梯形，通道顶宽５８ｐｍ，底宽３０ｐｍ，深２０ｐｍ，青岛科技大学研究生学位论文分离通道ｅ、ｄ之间的长度为５ｃｍ，从缓冲液池ａ池到双Ｔ点长５ｍｍ（ａｅ＝５ｍｍ），样品池ｂ及样品废液池ｃ至分离通道的距离为５ｉｎｎｌ（即ｂｅ＝ｏｆ＝－５１１１】【１１）；ａ，ｂ，ｃ三池直径２１１１１１１。双Ｔ点两通道中心间隔２００ｐｍ（ｅｆ＝２００ｒｉｍ）。图３－２ＰＤＭＳ芯片的构造图ａ．缓冲溶液池；ｂ．样品废液池；Ｃ．样品池；ｄ检测端Ｆｉｇ．３—２ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰＤＭＳｍｉｃｒｏｃｈｉｐａ，ｂｕｆｆｅｒｃｅｌｌ；ｂ，ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｃｅｌｌ；Ｃ，ｓａｍｐｌｅｃｅｌｌ；ｄ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｅｃｔｉｏｎ３．２．３．３微流控芯片／柱端安培检测系统的制作微流控芯片电化学检测器的实验装置如图３．３所示，将ＰＤＭＳ芯片粘贴到一长７．５ｃｍ，宽３．０ｃｍ，厚２ｎｌｌｎ的玻璃片７上，再将做好的三电极检测池用ＡＢ胶粘合在玻璃片的末端。然后将粘有芯片及检测池的玻璃片固定在一空白磁带盒的底部，将工作电极插入到引导管中，借助于显微镜调整电极的位置使之与分离通道出口端对齐并保持一定的距离（￣２０１Ｊｍ）。皓————————————一７．５ｃｍ————————————＊２＋２ｅｒａ—爿．＾．々矿Ｐ磊ｌｅｆＩ一ｕ下ｌ‰上≮ｅ／。图３．３微流控芯片电化学检测器＼么ｄ：似Ｓ＼、１２ａ．缓冲液池；ｂ．样品废液池；ｃ．样品池；ｄ．检测端；１．有机玻璃板；２．检测池；３．辅助电极；４．高压负极；５．引导管；６．参比电极；７．玻璃片Ｆｉｇ．３－３Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅｏｆｍｉｃｒｏｃｈｉｐａ．ｂｕｆｆｅｒｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｂ．ｓａｍｐｌｅｗａｓｔｅｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；Ｃ．ｓａｍｐｌｅｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｄ．ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｅｃｔｉｏｎｌ，ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓｂｌｏｃｋ；２，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；３，ａｓｓｉｓｔａｎｔｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；４，ｃａｔｈｏｄｅｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ；５，ｇｕｉｄｅｔｕｂｅ；６，Ａｇ／ＡｇＣｌｗｉｒｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；７，ｇｌａｓｓｐｌａｔｅ微流控芯片单细胞分析用一次性注射器将运行缓冲液注于ａ，ｂ，ｃ三个池中并将ＰＤＭＳ的分离通道用缓冲液充满，随后将检测池２中充满电泳缓冲液即可进样进行电泳分离检测。３．２．３４ＰＤＭＳ芯片的封装ＰＤＭＳ芯片在使用前要紧密粘贴在载玻片上，称之为芯片的封装。采用可逆封装，具体操作过程是，首先将用于封装的各部分表面用无水乙醇和二次水反复清洗后用干净的氮气吹干，然后直接将上面有微通道的ＰＤＭＳ芯片与玻璃片接触粘合，并用卡子将两片紧紧卡住，放入烘箱中８０＇Ｃ下处理１０分钟左右，这样得到的ＰＤＭＳ微流控芯片用外力可以撕开，过程可逆，这样制得的芯片的优点是便于微通道的清洗。缺点是封装强度不高，操作不小心容易精液。３２．３５碳纤维簇微盘工作电极的制作参考文献Ｃ１，所不同的是在碳纤维与铜丝紧密接触的一端采用焊锡密封，这样就避免了ＡＢ胶沿铜丝流入针管内碳纤维与铜丝接触端而易产生的接触不良现象，提高了制作电极的成功率。Ｂ《＝主压彝囊虱垂垂再蕈■－——＿＼４５Ｃ亘ｃ＝ｊ臣重量室妻垂ｉ望日一６／、７Ｄ一６ＡＢｇｕｍ；７ｓｏｌｄｅｒｉｎｇｔｉｎＥｊｅ匡重量垂藁垂重量＿＿一目３４碳纤堆簇微盘电板的制作过程碳纤雎；２石英毛细管；３５０２胶，４针头钢管；５铜丝；６ＡＢ胶：７焊锡Ｆｉｇ３－４Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｃａｒｂｏｎｆｉｂｒｅｅｌｏｃｌｒｏｄｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ１，ｃｉｔｌｌ００１］ｆｉｂｒｅ；２，ｑｕａｒｔｚｅａｐｉｌｌａｒｙ；３，５０２ｇｕｍ；４，ｓｔｅｅｌｔｕｂｅ；５，ｃｏｐｐｅｒｗｉｒｅ；具作过程如图３＿４所示，取几束直径６／ａｍ碳纤维放在无水乙醇中超声清洗约１０ｍｉｌｌ，晾干待用。将内径为２５０／ａｍ的石英毛细管用毛细管刀切割成约６－８ｃｍ长，用金相砂纸画“８”字型磨平；取约５ｃｍ长的铜丝，将两端磨平；将８号针头截取约４－５ｅｍ长（保留针尖部分），将截断部分用粗砂纸磨平（确保针头畅青岛科技大学研究生学位论文通，且能插入石英毛细管），处理后的石英毛细管和针头置于无水乙醇中超声清洗３—５ｍｉｎ。取一束碳纤维（约２０．３０根）一端占少许丙酮，插入石英毛细管中，露出约Ｏ．５ｃｍ碳纤维，将碳纤维一端插入５０２胶中，由于毛细现象，５０２胶沿毛细管上升，充满毛细管（图３＿４Ａ）。待胶干燥后，将其插入已磨好的８号针头中，从针尖一端插入铜丝，尽量使铜丝在针头内与碳纤维密切接触（图３＿４Ｂ）。用ＡＢ胶封住针头与石英毛细管的交界处，待胶干燥后，然后把露在外面的碳纤维剪去，用焊锡封住铜丝与针头的交界处（图３－４Ｃ）。将石英毛细管端露在外面的碳纤维剪平，用金相砂纸磨平，使之与毛细管出口端平齐（图３－４Ｄ）。之后依次在Ｏ．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ溶液，过滤后的二次蒸馏水中用超声波清洗３．５ｍｉｎ，即可用于电泳检测。３．２．３．６碳纤维簇微盘电极的处理同２．２．３．２３．２．３．７循环伏安法检测碳纤维簇微盘电极电化学性能向微型电解池中移入５０｝ｘＬ０．００５ｍｏｌ·Ｌ．１铁．０．２０ｍｏｌ·Ｌ．１氯化钾溶液，把碳纤维簇微盘工作电极、辅助电极和参比电极插入溶液中，接通电解池，记录循环伏安曲线；记录完后，清洗电解池。测得的氧化还原峰形对称，氧化还原电位差小于１００ｍＶ，可以判断电极性能良好，３．２．３．８微流控芯片／柱端安培检测ＰＤＭＳ芯片使用前依次用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ，纯水分别超声清洗１５ｍｉｎ和５ｍｉｎ以预处理通道，电极使用之前也要依次用Ｏ．１ｍｏｌ·Ｌ．１ＮａＯＨ，纯水分别超声清洗２～３ｍｉｎ，然后在在显微镜下使碳纤维工作电极和通道出口对齐，并且保持１０－２０ｌ，ｔｍ的距离。最后，用ＡＢ胶将电极固定。进样采用简单进样的方式，即进样的时候ｂ，ｃ端施加电压１０００Ｖ，ｃ端接地，ａ，ｄ端悬空。在第一次进样的时候，为了使样品能够充满ｂ．ｃ之间，一般需要加电压稍长的时间（１０ｓ），以后的进样时间为５ｓ。分离时ａ，ｄ端施加分离电压１１００Ｖ，ｄ端接地，ｂ，ｃ两端悬空。工作电极的电势均是相对于Ａ跳ｇＣｌ参比电极。３．３结果与讨论３．３．１柱端安培检测装置的设计思路在芯片毛细管电泳．安培检测系统中，采用圆盘电极柱端安培检测是一种简单有效的检测方法。这主要是因为，对于柱端检测方式，工作电极直接放置于分离３７微流控芯片单细胞分析通道出口的正对面，样品柱离开分离通道后直接冲向圆盘电极的表面，样品带扩散小，检测灵敏度高。文献报道【ｌ引，在电极与通道出口保持一定距离，与通道轴心位置的偏差在一定范围内，分析物在电极表面产生的极限电流变化很小，有很好的重现性。此外，柱端喷壁式检测方式可以方便地更换工作电极，利于电极表面的清洗与再生。然而，对于柱端安培检测，工作电极的准确定位是先决条件，在毛细管电泳中通常使用精密微操纵器和显微镜来实现¨引。为了简化操作步骤并提高电极定位的准确度，各种不同设计的检测器相继出现【２０Ｊ。因此，在文献调研的基础上综合考虑，我们设计集成化微流控芯片．安培检测系统的思路主要基于以下几点：（１）选用体积小、灵敏度高且方便制作的碳纤维簇微盘电极（ｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏ．ｄｉｓｋｂｕｎｄｌｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ，ＣＦＭＢＥ）为工作电极，并在原有基础上进行了改进，实现工作电极性能稳定且便于更换的目的；（２）采用ＰＤＭＳ．玻璃芯片，通过可逆键合，实现分离通道易于清洗的目的；（３）在检测池上进行电极引导装置的准确定位，设计的检测器所用引导管端口的内径约为３８５ｌａｍ，所制电极的外径为３７５Ｉ－ｔｍ。将引导管准确对准通道出口并固定后，能保证电极在插入引导管后与通道的纵向偏差被控制在５岬以内，对检测灵敏度影响很小。３．３．２工作的电极的循环伏安性能将电极在０．００５ｍｏｌ·Ｌ。１铁溶液中进行循环伏安扫描，如图３．５所示，由图可以看出碳纤维簇微盘电极氧化还原峰形对称，氧化还原电位差小于８０ｍＶ，电化学性能良好。《心．毫．ｏ．２ｏ．ＯＰｏｔｅｎｔｉｉａＷｏ．２０．４０．６０．８图３．５碳纤维簇微盘工作电极的循环伏安曲线图Ｆｉｇ．３－５ＣｕｒｖｅｓｏｆｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙｉｎｃａｒｂｏｎｆｉｂｒｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：０．００５ｍｏｌ·Ｌ１Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６】－０．２０ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ３８青岛科技大学研究生学位论文３．３．３微流控芯片检测系统的电泳性能为了验证设计和制作芯片电化学检测系统的实际性能，实验以电化学检测常用的抗坏血酸（ａｓｃｏｒｄｉｃａｃｉｄ，ＡＡ）和多巴胺（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）作为模拟分离物，得到了ＡＡ和ＤＡ电泳图并在９０ｓ内完成了这两种物质的分离。图３—６是在自制的芯片电化学检测器上ＡＡ和ＤＡ的电泳图。可见，ＤＡ在４５ｓ出峰，ＡＡ在８５ｓ处出峰，峰形对称且相对尖锐，图３．６的结果证明，自制的微流控芯片电化学检测系统可以成功用于电活性物质的分析。２０４０６Ｄ８０ｌＯＯ１２０ｔ／Ｓｍ图３－６ＡＡ和ＤＡ的电泳图Ｆｉｇ．３－６Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ５．０ｘｌ０４ｍ０１．Ｌ．１ＡＡ．１．０ｘｌ０４ｍ０１．Ｌ－１Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ－１．０ｘｌ０一ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０），ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，１．１ｋＶ；ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｏ．８０Ｖ（坩．．Ａｇ／ＡｇＣｌ）；ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，１．０ｋＶｘ５ｓ．３．３．４工作电极定位的重现性以抗坏血酸为分析对象，碳纤维簇微盘电极为工作电极，反复多次安装电极，考察了我们所研制的带有电极引导装置的微流控芯片对微盘工作电极定位的重现性。对抗坏血酸连续进样分离３次，电泳图示于３．７，可以看出，三次连续进样ＡＡ的峰形完全一致，基线均较为平稳。然后退出电极，处理后重新安装，再进行进样、分离检测。每次安装后平行测定的ｆｐ的相对标准偏差（ＲＳＤ）最小为１．１％，最大为４．７％，平均值为２．９％；对每次安装电极后平行测定的平均值进行统计，７次安装蠢的相对标准偏差（ＲＳＤ）为３．１％。这表明，采用这种微流控芯片安培检测装置，由于工作电极对准不确定度所引起的偏差与进样、分离所引起的偏差相当。电化学检测的重现性良好。３９微流控芯片单细胞分析∞：０９０霉０己。ｊ５１００１１０ｌ麓ｇ孕？０＆０争０１００１１０ｌ：治唇０７０８０奎０１００１１０１２。善‘ｍｋ’５图３．７ＡＡ的连续进样电泳图‘ｍ。ｊＳＦｉｇ．３．７Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｏｆ５．ＯＯｘｌ０４ｍ０１．Ｌ～ＡＡ，ｔｈｅｓａｍｅａｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０－２ｍｏｌ·Ｌ．１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０），ｏｔｈｅｒｓＦｉｇ．３．６．３．４结论本文研制的集成化微流控芯片电化学检测系统体积小，装置简单，无需精密微操纵器，易于操作。自制的碳纤维簇微盘电极具有良好的电化学响应。工作电极通过引导管准确定位，成功检测了５．ＯＯｘｌＯ。４ｍｏｌ·Ｌ．１抗坏血酸，峰形良好，连续３次进样，重现性良好。重复安装工作电极对抗坏血酸样品如相对标准偏差（ＲＳＤ）仅为３．１％。初步证明了自制的微流控芯片电化学检测系统的可行性。青岛科技人学研究生学位论文参考文献【１】ＭａｎｚＡ．，ＦｅｔｔｉｎｇｅｒＪ．Ｃ．，ＶｅｒｐｏｏｒｔｅＥ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇｏｆｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅｓｉｌｉｃｏｎａｎｄｇｌａｓｓｆｏｒｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］，Ｔ．ｉｎＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９１，１０（５）：１４４－１４９Ｓｅｉｌｅｒ［２】ＨａｒｒｉｓｏｎＤ．Ｊ，ＦｌｕｒｉＫＫ，ｅｔ．ａｌ，ＭｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓａＭｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ—ＢａｓｅｄＣｈｅｍｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｏｎａＣｈｉｐ［Ｊ］，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６１：８９５．８９７［３］ＤｏｌｎｉｋＶ．，ＬｉｕＳ．，ＪｏｖａｎｏｖｉｃｈＳ．，ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）－ｆａｂｒｉｃａｔｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２１：４１－５３［４】ＬｉａｎｇＺ．Ｈ．，ＣｈｉｅｍｎＯ．Ｇ．，ｅｔ．ａ１．，ＭｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆａＣｅｌｌｆｏｒＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＰｌａｎａｒＡｂｓｏｒｂａｎｃｅａｎｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＤｅｖｉｃｅｓ［Ｊ］，Ａｎａ．Ｃｈｅｍ，１９９６，６８：１０４０－１０４６ＳｉｎｇｌｅＣｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ【５】ＦｉｓｔｅｒＪ．Ｃ．，ＪａｃｏｂｓｏｎＳ．Ｃ．，ＤａｖｉｓＬ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｏｕｎｔｉｎｇｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅｓｆｏｒＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓ４３１＿４３７ａｎｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＭｉｃｒｏｃｈｉｐＤｅｖｉｃｅｓ［Ｊ】，Ａｎａ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，７０：［６】ＷａｎｇＪ．，ＴｉａｎＢ．，ＳａｈｌｉｎＥ．，ＭｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＣｈｉｐｓｗｉｎｌＴｈｉｃｋ·ＦｉｌｍＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｏｒｓ［Ｊ］，ＡｎａＬ［７】ＭａｒｔｉｎＲ．Ｓ．，ＧａｗｒｏｎＣｈｅｍ．，１９９９，７１：５４３６—５４４０Ａ。ＪＬｕｎｔｅＳ．Ｍ．，ＨｅｒｒｙＣＳ．Ｄｕａｌ—ＥｌｅｃｔｒｏｄｅＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＭｉｃｒｏｃｈｉｐｓ［Ｊ］，ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＰｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）一ＦａｂｒｉｃａｔｅｄＡｎａｌＣｈｅｍ．，２０００，７２：３１９６·３２０２［８］８ＺｅｎｇＹ．，ＣｈｅｎＨ．，ＰａｎＤ．Ｗ．，Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｍｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ·ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００２，７４：２４４１－２４４５Ｌ．Ｅ．，Ｇａｉｔａｎ【９】ＭａｒｔｙｎｏｖａＬ．，ＬｏｃａｓｃｉｏＭ．，ｅｔ．ａｌ，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｔｉｃｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｃｈａｎｎｅｌｓｂｙｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９７，６９：４７８３－４７８９【１０】ＭａｋａｍｂａＨ．，ＫｉｍＪ．Ｈ．，Ｌｉｒａｋ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｕｒｆａｃｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３，２４：３６０７—３６１９【１１】ＭａｒｔｉｎＲ．Ｓ．，Ｇａｗｒｏｎｏｆｐｏｌｙ（ｄｉｍｅ－ｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）Ａ。ＪＬｕｎｔｅＳ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｕａｌ—ＥｌｅｃｔｒｏｄｅＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＰｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）ＦａｂｒｉｃａｔｅｄＣａｐｉｌｌａｒｙ２０００，７２：３１９６—３２０２Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ［Ｊ］，ＡｎａＬＣｈｅｍ．，［１２】ＭｃＤｏｎａｌｄＪ．Ｃ．，ＤｕｆｒｙＤ．Ｃ．，ＡｎｄｅｒｓｏｎＪ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ，Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｓｉｎｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０００，２１：２７－４０【１３】ＸｕＷ：，Ｕｃｈｉｙａｍａｋ，ＳｈｉｍｏｓａｋａｃａｐｉｌｌａｒｙＴ．，ｅｔ．ａｌ，Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｅｓｔｅｒｍｉｃｒｏｃｈｉｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０００，２：７６２·７６３Ｊ．Ｃ．，ＳｃｈｕｅｌｌｅｒＯ．Ｊ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ，ＲａｐｉｄＰｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇｏｆ［１４】ＤｕｆｆｙＤ．Ｃ．，ＭｃＤｏｎａｌｄＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＳｙｓｔｅｍｓｉｎＰｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）［Ｊ】，ＡｎａＬＣｈｅｍ．，１９９８，７０：４９７４－４９８４４１微流控芯片单细胞分析［１５】ＳｉａＳ．Ｋ，ＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓＧＭ．，Ｍｉｃｒｏｎｕｉｄｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｖｉｃｅｓｆａｂｒｉｃａｔｅｄｉｎｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）ｆｏｒｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００３，２４：３５６３—３５７６［１６】ＰｒｅｓｔＪ．Ｅ．，ＢａｌｄｏｃｋＳ。ＪＦｉｌｅｄｅｎＰ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｅｔａｌｃａｔｉｏｎｓｏｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｓｅｄｐｌａｎａｒｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｖｉｃｅｓｕｓｉｎｇｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ】，ＴｈｅＡｎａｌｙｓｔ，２００１，１２６：４３３＿４３７［１７】ＳｕｎＸ．Ｍ．，ＮｉｕＹ，ＢｉＳ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｒａｔｅｐａｔｏｃｙｔｅｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ２００８，８７０：４６—５０ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，［１８】ＭａｔｙｓｉｋＦ．Ｍ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＣｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎｗｉｔｈ２５８１．２５８６ＮｏｎａｑｕｅｏｕｓＣａｐｉｌｌａｒｙｏｆＥｎｄ－ＣｏｌｕｍｎＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，７２：［１９］ＭａｔｙｓｉｋＦ．Ｍ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄｅｎｄ－ｃｏｌｕｍｎａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ【Ｊ】，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９６，７４２：２２９－２３４［２０】ＺｈｏｎｇＭ．，ＬｕｎｔｅＳ．Ｍ．，ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＯｎ－ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９６，６８：２４８８－２４９３４２青岛科技大学研究生学位论文第四章微流控芯片电化学检测大鼠腹腔肥大细胞中的抗坏血酸４．１引言抗坏血酸（维生素Ｃ，ａｓｃｏｒｄｉｃａｃｉｄ，简称ＡＡ）是维持机体正常生理功能的主要维生素之一【１】。它具有抗氧化和提高机体免疫力的作用【２】，广泛参与机体的氧化、还原等复杂代谢过程，能促进细胞生长和抗体的形成，增强对疾病的抵抗力【３】，参与解毒功能，还有助于铁的吸收，抗炎、抗过敏作用。另外，抗坏血酸在体内与其它还原剂共同作用，保持细胞氧化还原电势，防止酶系统被氧化物所破坏，亦能促进细胞间质的生成。临床研究表明，一些疾病的发生与人体中ＡＡ含量的多少有密切关系【４。５１。同时对动物细胞中的抗坏血酸的检测具有更重要的生理意义，它能揭示抗坏血酸在人体中重要的生理功能，以及抗坏血酸与某些疾病的关系等，为人类攻克某些疾病提供数据。对于抗坏血酸的研究早已引起人们的普遍关注，方法多种多样，主要有电化学法【６】，荧光澍７】，色谱法［８Ｊ，化学发光分析法［９１。但是上述各类分析方法，由于方法本身灵敏度较低，受干扰因素较多。微流控芯片作为ｐＴＡＳ的一个领域，基于其极少的进样体积、良好的散热性能和相对高的场强及可能带来的超高速分离等一系列优点【ｌｏ】，在ｌａＴＡＳ发展的前十多年中得到飞快的发展，成为目前ｐＴＡＳ发展领域中令人瞩目的一个分支。微流控芯片技术和功能的日趋强大，使其在生化研究领域中发挥了重要作用。微流控芯片已经应用于ＤＮＡ序列测定，与聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增技术结合及核苷酸分离、ＤＮＡ分离、氨基酸分离、多肽和蛋白质的分离、免疫分析以及单分子检测【１１１。灵敏和小型的检测器对于充分展示微流控芯片的优点极为重要。电化学检测是一种灵敏的检测方法，具有内在的可小型化性。目前，微流控芯片结合柱端安培检测测定大鼠腹腔肥大细胞中的抗坏血酸的研究尚未见报道。本文利用自制的微流控芯片柱端安培电化学检测系统，以碳纤维簇微盘电极作为工作电极，详细研究了抗坏血酸检测的最佳条件．建立了一种可以准确、方便测定少量组织或细胞中抗坏血酸含量的方法。为下一步单个细胞中抗坏血酸的测定作准备。方法的优越性在于仅需少量的被测样品，分析时间短，可广泛的应用于生物体中抗坏血酸的测定。４３微流控芯片单细胞分析４．２实验部分４．２．１仪器三电极系统：碳纤维工作电极，微Ａｇ／ＡｇＣｌ参比电极（浸泡在饱和氯化钾溶液中），铂丝辅助电极。离心机（ＴＤＬ－４０Ｂ，上海安亭科学仪器厂）；血球细胞计数板（玉环县求精医用仪器厂，玉环，浙江）；其余同３．２．１。４．２．２材料与试剂４０％Ｆｉｃｏｌｌ溶液：称取Ｆｉｃｏｌｌ－４００（ＰｈａｒｍｃｉａＣｏｍｐａｎｙ，Ｓｉｎｏ－ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏｔｅｃ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）２．２４ｇ，溶解定容至５ｍＬ容量瓶中。淋巴细胞分离液：（密度１．０７７－ｔ－０．００２ｇ．ｍＬ。１）购白天津灏洋生物制品科技有限责任公司。肥大细胞分离液（比重１．０８５ｇ－ｍＬＪ）：取比重１．１２０ｇ．ｍＬ。４０％Ｆｉｃｏｌｌ溶液１．８６ｍＬ，加入比重１．０７７ｇ．ｍＬ‘１的淋巴分离液８．１４ｍＬ后混匀，用于肥大细胞分离。细胞清洗液（ＰＢＳ）：Ｏ．１４６ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣＩ．０．００６ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＨ２Ｐ０４．０．０１４ｍｏｌ·Ｌ－１ｇＮａ２ＨＰ０４（ｐＨ７．４），准确称取２．１３ＮａＣＩ（天津市博迪化工有限公司），０．２１８ｇｇＮａＨ２Ｐ０４。２Ｈ２０（天津市博迪化工有限公司），１．２９至７．４。大白鼠（青岛药检所，青岛）：体重约２００其余同３．２．２。ｇＮａ２ＨＰ０４‘１２Ｈ２０（天津市广成化ｍｏｌ·Ｌ－１学试剂有限公司，ＡＲ），定容至２５０ｍＬ容量瓶中，用０．２ＮａＯＨ将ｐＨ调４．２．３实验方法４．２．３．１碳纤维簇微盘工作电极的制作同３．２．３．５。４．２．３．２碳纤维簇微盘电极的处理同３．２．３．６。４．２．３．３肥大细胞分离及处理按文献‘１２１方法分离大鼠腹腔的肥大细胞。将大鼠置于封闭的小桶，用乙醚将其麻醉致死。小心剪开大鼠腹部皮肤，用注射器针头穿透肌肉层，向腹腔内注入３０ｍＬＰＢＳ溶液。轻揉大鼠腹部约２Ｉｎｉｎ后，剪开肌肉层，收集大鼠腹腔冲洗液，青岛科技火学研究生学位论文离心后去上清液加入ＰＢＳ，将细胞打匀制成悬浮液，取细胞悬浮液沿管壁缓慢加入盛有肥大细胞分离液的离心管中，使两液形成界面。４℃下，２５００ｒ／ｍｉｎ离心１５分钟，使肥大细胞沉于管底，再倾出上层溶液取底部肥大细胞，用冷的ＰＢＳ清洗２次，４。Ｃ，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ。按文献【１３Ｊ处理肥大细胞，将４℃细胞悬液，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，倾去上清液，加入运行缓冲溶液约ｌｍＬ，在超声波中超２０ｍｉｎ后，１０００ｒ／ｒａｉｎ，离心１０ｍｉｎ，取上清溶液用运行缓冲液定容至１．５ｍＬ，４。Ｃ冰箱冷藏备用。４．２．３．４肥大细胞的计数我们使用血球计数板计数肥大细胞个数。血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面，刻有一个方格网，方格网上刻有９个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物和细胞计数用。这一大方格的长和宽各为１ｒａｉｎ，深度为Ｏ．１ＩＩｌｌｎ，其体积为０．１ｎｌｌｌｌ３。计数室通常有两种规格，一种是大方格内分为１６中格，每一中格又分为２５小格；另一种是大方格内分为２５中格，每一中格又分为１６小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由１６ｘ２５＝２５ｘ１６＝４００个小方格组成。本实验使用１６格ｘ２５格规格的计数室。（１）将血球计数板用擦镜纸擦净，在的计数室上加盖专用的厚玻片。（２）将处理好的肥大细胞悬浮液，用移液管吸取少量置于盖玻片的边缘，使细胞悬液缓缓渗入，多余的用吸水纸吸取，稍待片刻，使肥大细胞全部沉降到血球计数室内。（３）计数时，当遇到位于中格线上的肥大细胞，只计数方格的上方和右方线上的肥大细胞（或只计数下方和左方线上的肥大细胞）。（４）使用１６格ｘ２５格规格的计数室，按对角线位，取左下、右下、左上、右上４个中格和的一个中格（即共８０个小方格）的肥大细胞数。（５）按公式：肥大细胞个数／ｍＬ＝８０个小格内的细胞个数＋８０ｘ４００ｘ１０４×稀释倍数，计算每１ｍＬ细胞悬浮液中所含有的肥大细胞个数。４．２．３．５微流控芯片／柱端安培检测同３．２．３．８。４５微流控芯片单细胞分析４．３结果与讨论４．３．１抗坏血酸的循环伏安特性在ｐＨ９．０的１．００ｘ１０之ｍｏｌ·Ｌ－１的硼酸缓冲溶液中做循环伏安曲线，循环伏安图示于图４．１，曲线１是１．００ｘ１０～ｍｏｌ·¨１的硼酸缓冲溶液的循环伏安曲线；图４．１中曲线２是在１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ＿１的硼酸缓冲溶液条件下１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ。抗坏血酸的循环伏安曲线。比较图４．１中的两条曲线可以看出，曲线１中没有峰电流信号，在曲线２中有一个明显的阳极峰，由此说明抗坏血酸具有电化学活性，可用电化学方法进行直接检测。‘（Ｖ）图４．１抗坏血酸的循环伏安曲线图Ｆｉｇ．４－１Ｃｕｒｖｅｓｏｆｃｙｃｌｉｃｖｏ｜ｔａｍｍｅｔｒｙｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ１，１．００ｘ１０－２ｍｏｌ·Ｌ＋１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ９．０；２，（１）＋１．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ４．３．２微流控芯片／柱端安培检测抗坏血酸的检测条件的选择４．３．２．１缓冲液ｐＨ值的影响不同的ｐＨ值下测得的峰电流ｉｐ如图４－２所示。由图可以看出，当缓冲溶液ｐＨ为９．０时，峰电流最大。所以将缓冲溶液定为ｐＨ值９．０的硼酸溶液。青岛科技大学研究生学位论文场¨ｎ如８ｖｕ》６４２Ｏ７８９ｌＯ１１ｐＨ图４－２缓冲液的ｐＨ值对ＡＡ的昂的影响Ｆｉｇ．４－２ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｂｕｆｆｅｒｐＨｏｎｉｐｏｆＡＡＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：５．００ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１ＡＡ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，１．１ｋＶ；ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，０．８０Ｖ（Ⅷ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）；ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，１．０ｋＶｘ５ｓ．４．３．２．２缓冲液浓度的影响在不同的缓冲液浓度下，以ＣＢ表示硼酸缓冲溶液的浓度，检测ＡＡ的易及ｔｍ，以ＣＢ对ｉｐ，ＣＢ对ｔｍ作图示于图４－３。由图４－３可以看出，迁移时间随缓冲液浓度的增大而增大。望害《｛．乒０４８１２１６２００５１０１５加ｃＢ咖橱．Ｌ－ｌ例．ｆ１图４－３ＣＢ对ＡＡ的ｆｍ和易的影响Ｆｉｇ．４－３Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｏｎｔｍａｎｄ易ｏｆＡＡＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｐＨ９．０：ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．４－２．４７微流控芯片单细胞分析在芯片毛细管电泳中，物质的迁移速度主要取决于电渗速度。当溶液浓度增加时，电双层的紧密层变薄从而使电渗速度降低，因此ｔｍ增大。易值在ＣＢ为１．０ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１时有最大值，因此我们选择在ＣＢ＝１．０ｘ１０乏ｍｏｌ·Ｌ．１为缓冲液浓度，即选择１．０ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１的硼酸缓冲溶液，此时，峰电流ｆｐ值最大，其基线噪音较小。４．３．２．３分离电压的影响在不同分离电压蚝下，测定ＡＡ的迁移时间‰和峰电流易所得蚝对易，圪对‰的曲线示于图４－４。由图４．４可见，随分离电压增大，迁移时间减小，峰电流在１．１ｋＶ最大，大于１．１ｋＶ时由于焦耳热的影响，电渗流不稳定，基线噪音增大，出现拖尾现象。综合考虑，选择１．１ｋＶ作为电泳分离电压。≮《曼．乒０．８０．９１．０１．Ｉ１．２１．３０．８ｏ．９１．ｏ１．１１．２１３Ｖ／ｋＶ图４－４Ｋ对ＡＡ的ｆｎｌ和ｉｐ的影响Ｆｉｇ．４－４Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１Ｉ，ｏｎｔｍａｎｄｉｐｏｆＡＡＶｇｋＶＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．Ｏ），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．４－２．４．３．２．４检测电势的影响固定进样条件和分离条件，改变检测电势玩，测定ＡＡ的ｉｐ值，所得函对ｉｐ曲线示于图４－５，从图４－５可以看出随着检测电势的升高，峰电流逐渐增大，但同时噪音信号也呈上升趋势，因此选择信噪比较好的Ｏ．８Ｖ作为检测电势。青岛科技大学研究生学位论文７６５司ｕ／乒４３２ｌ０．６０．７ｏ．８０．９１．０Ｅ心图４－５Ｅｄ对ＡＡ的昂的影响Ｆｉｇ．４－５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｏｆ玩ｏｎｆｐｏｆＡＡｔｈｅｓａｍｅａｓｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０），ｏｔｈｅｒｓＦｉｇ．４－２．·４．３．２．５抗坏血酸的标准电泳图根据以上数据，确定最佳检测条件为：ｐＨ９．０的１．Ｏ×１０～ｍｏｌ·Ｌ。１硼酸缓冲溶液，分离电压为１．１ｋＶ，检测电势为Ｏ．８Ｖ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ），在此条件下测定。１．０ｋＶ进样５ｓ时５．００ｘ１０。４ｍｏｌ·Ｌ．１ＡＡ的电泳图示于图４．６。６０７０Ｓ０；咯１００ｌｌ巷崭ｓ图４．６ＡＡ的标准溶液的电泳图Ｆｉｇ．４－６Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ５．００ｘ１０。４ｔ００１．Ｌ－１ＡＡＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０五ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅ髂Ｆｉｇ．４－２．４．３．２．６抗坏血酸的线性范围、检测限及重现性配制一系列不同浓度的ＡＡ标准溶液，在以上优化的条件下，测定不同浓度下的峰电流ｆｐ值，以ｌｇｃ对ｌｇｆｐ作图，示于图４．７，得到了ＡＡ的线性范围（８．００×１０击４９微流控芯片单细胞分析．５．００×１０４ｍｏｌ－Ｌ－１），线性回归系数为Ｏ．９９６２，并以电泳峰电流与噪声比值（踟为－７．８．８．Ｏ－８．２－８．４．８．６３时得到浓度检测限２．７０ｘｌＯ。６ｍ０１．Ｌ－１。．．９．８．８∞一－９０．９．２．９．４—９．６．９．８－３．２－３．０－４．８－４．Ｏ－４．４－４．２－４．０－３．８－３．６－３．４－３．２ｌｇｃ图４－７抗坏血酸的ｉｐ（Ａ）与Ｃ（ｍｏｌ‘Ｌ－１）的对数关系图Ｆｉｇ．４－７Ｓｔａｎｄａｒｄｗｏｒｋｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆｌｇ‘ｔＯｌｇｃａｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．ＯＯｘｌＯ之ｍｏｌ·Ｌ．１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．Ｏ），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅＦｉｇ．４．２．实验所用芯片通道截面为梯形，考虑到样品柱的扩散和泄漏问题，参照文献【１４】方法测得样品柱长度为３３０ｐｍ，可算出抗坏血酸的进样体积为０．３４ｎＬ，相应的质量检测限为１．０ｆｍｏｌ，将ＡＡ（５．ＯＯｘｌＯ。４ｍｏｌ·Ｌ‘１）标准溶液连续进样７次，得ｋ和ｆｐ的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为１．３％和２．９％。４．３．３肥大细胞溶膜液中抗坏血酸的测定４．３．３．１定性吸取已准确定容的肥大细胞测定液１ｍＬ在最佳条件下进行测定微流控芯片柱端安培检测，得到的电泳图示于图４．８曲线２，在相同条件下所作的标准抗坏血酸溶液电泳示于曲线１。由两曲线对比可看出，在肥大细胞测定液中的电泳峰与标准抗坏血酸溶液的电泳峰有相同的迁移时间。而且由溶膜液加标回收率的实验测定结果图４．９可以看出，在肥大细胞测定液中加入一定量的抗坏血酸，所得电泳图（图４．９中曲线２．４）与图４—８中曲线１对比，发现迁移时间没有变化，电泳峰明显升高，但峰宽没有增大。因此可以确定图４．９曲线１中的电泳峰为抗坏血酸。５０青岛科技大学研究生学位论文２＾Ｊ·。“．、．．．．．．．，广１—Ｔ—１＿—广—’］广１—Ｔ—Ｔ＿１巷０殆酌鳓１００１１０￡Ｉｌｌ？Ｓｊ图４－８Ｉ，ＡＡ的标准溶液的电泳图；２，大鼠腹腔肥大细胞溶膜液的电泳图；Ｆｉｇ．４．８Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ１，３．０ｘ１０５ｍｏｌ。Ｌ—ＡＡ；２，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｏｆｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．０ｘ１０＂２ｍｏｌ·Ｌ－１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．０），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．４－２．４．３．３．２定量及回收率取１ｍＬＩＪ巴大细胞测定液，用标准曲线法定量得到ＡＡ浓度为２．８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１，通过肥大细胞预处理时的细胞计数，已知肥大细胞浓度为５．７×１０５ｃｅｌｌ·ｍＬ－１，因此可计算出单个肥大细胞中的ＡＡ平均含量为４．９ｆｍｏｌ。用标准加入法测定的电泳图示于图４．９中，回收率的计算结果列于表４．１中，回收率在９４．９７％之间，说明该方法准确可靠。ＡＡＡＡ１０．１ｎＡＡ．Ａ１～一～．～。２６０７０Ｅ０９０４ｒ。’’１。＿——ｒ‘’‘１”’’—ｒ—’１９０；０１００ｉ１０６０：０１００ｌｌ备巷０７０Ｓ０；０１０≥ｌｉ０巷０７０８’。争０１００１１０‰？ｓｆｍ‘ｓ锰’ｓ‰’’ｓ图４．９肥大细胞溶膜液回收率Ｆｉｇ．４—９ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆｍａｓｔｃｅｌｌｅｘｔｒａｃｔｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆＡＡ．ＴｈｅａｄｄｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡＡ：（１）０；（２）８．７ｘ１０击ｍｏｌ‘Ｌ’１；（３）２．６ｘ１０。５ｍｏｌ＋Ｌ。１；（４）５．２ｘ１０－５ｍｏｌ’Ｌ．１．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．０ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ。１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．Ｏ），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．４．２．５１微流控芯片单细胞分析Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．Ｏｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ一１ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．Ｏ），ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．４．２．４．４结论采用自制的微流控芯片电化学检测装置，以碳纤维簇微盘电极为工作电极，检测抗坏血酸，经实验测定在ｐＨ９．０的１．０×１０～ｍｏｌ·Ｌ－１的硼酸缓冲溶液中，检测电势为Ｏ．８Ｖ，分离电压１．１ｋＶ为最佳条件，进样方式为１．０ｋＶ下电迁移进样５Ｓ。在此优化条件下抗坏血酸的浓度与峰电流呈良好的线性关系，线性范围为８．０ｘ１０－６－５．Ｏｘｌ０４ｍｏｌ·Ｌ～，相关系数为０．９９８５，浓度检出限ＬＯＤｃ为２．７ｘｌＯ。６ｍｏｌ·Ｌ－１。并将该方法用于检测鼠肥大细胞中的抗坏血酸，加标回收率在９４．９７％之间。５２青岛科技大学研究生学位论文参考文献［１】朱怀荣，刘奥梅主编，生物化学，山东大学出版社，济南，１９８８：４３．５０【２】杜卫东，沈达明，黄春锦等，大剂量维生素Ｃ对急性胰腺炎患者细胞免疫功能的影响［Ｊ】，胃肠病学，２００２，７：２１３－２１５［３】ＪｉｎＷ．Ｒ．，Ｊｉａｎｇ，Ｌ．，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｓｉｎｇｌｅｈｕｍａｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｚｏｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３：２４７１．２４７６ＧｈａｓｅｍｉＶ．，ＲａｏｏｆＪ．Ｂ。，ＯｊａｎｉＲ，ｅｔ．ａｌ，Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｏｎａｆｅｒｒｏｃｅｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ·ｍｏｄｉｆｌｅｄｃａｒｂｏｎｐａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，ＢｕｌｌＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．，２００５，２１：１１５—１２２芦，Ｉｃｈｉｒｏｋ，ＴｏｓｈｉｏＩ．，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｓｃｏｒｂａｔｅａｎｄｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９７，６９：２１６—２２０陋，ＭｏｈａｍｍａｄＫ．Ａ．，ＳａｉｄＳ．，ＳｈａｈｒａｒｎＴ．，ＰＶＣ－ｂａｓｅｄＭｎ（ＩＩＩ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｍｅｍｂｒａｎｅ－ｃｏａｔｅｄｇｒａｐｈｉｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｉｄｉｎｅ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，７１：２５０２－２５０５ｐ，喻利娟，广西玉岭地区女性中小学生头发微量元素含量及其年龄变化的研究［Ｄ】，陕两杨陵：西北农林科技大学，２００２程义勇，生物医学微量元素数据手册［Ｍ】，天津科学技术出版社：天津，１９９６，１—１１２隅ｐ，，李峰，朱果逸，铬（Ⅵ）．过氧化氢噜米诺化学发光法测定痕量抗坏血酸［Ｊ】’分析化学２００２，３０：５８０．５８２ｎ王辉，林炳承，芯片国管电泳及其在生命科学中的应用，分析化学２００２，３０：３５９．３６４ｎ川ｕ陈国防，袁湘林，李彤，张玉奎，集成毛细管电泳沁片技术及其在生化研究方面的应用，分析科学学报２００１，１７：２５１．２５６ｎＹｉｎＨ．Ｌ．，Ｑｉａｎｚ．Ｅ，Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｓｔｕｄｙｏｆｍａｓｔｃｅｌｌａｎｄｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］，ＡｃｔａＡｎａｔｏｍｉｃａＳｉｎｉｃａ，１９９８，２９：８１－８５ｎ习马忠明，赵凯，钱伟钰，郑筱祥，组胺敏感离子选择性微电极及其应用［Ｊ】，分析化学，１９９７，２５：７５０．７５４ＵｑＶａｚｑｕｅａＭ．，ＭｃｋｉｎｌｅｙＧ．，ＭｉｍｉｋＬ．，ｅｔ．ａｌ，ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｆｉｃＩｎｊｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎＭｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ［Ｊ］，Ａｎａ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４：１９５２．１９６１５３微流控芯片单细胞分析第五章碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰电极一微流控芯片安培检测单个大鼠腹腔肥大细胞中的抗坏血酸５．１引言生命科学是本世纪前沿科学领域之一，生命科学的发展离不开研究手段，特别是分离、分析、测试方法的创新。生物组织中各种组分分布不均匀，因此进行生物微环境分析非常必要。细胞是生物体的基本单元，对单个细胞内化学组分的信息研究，有利于获得反映细胞生理状态和过程的更准确、更全面的信息，使人们能更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，对研究细胞内信号传递和重大疾病的早期诊断等有重要意义【ｌ】。细胞体积非常小（直径５岬一５００岬），体积（５ｆＬ．５ｎＬ），组分含量低（ｚｍｏｌ—ｆｍ０１）。因此对单细胞的研究要求分析方法具有高灵敏度、良好的选择性及超微体积的特点。微流控芯片是近年发展起来的一种新的分离技术，其小孔径、高电阻、抗对流、大比表面积等特性使其可在高电场、小电流下工作，实现高效、快速的分析，展现出了广泛的应用前景，而微流控芯片的微米尺寸的通道更适合单细胞样品的引入，操纵，反应，分离【２Ｊ和检测【３弓】。抗坏血酸（ＡＡ）广泛存在于食品、药物及人体中，它能够参与许多生物体内的反应，是维持生命活动的重要成分之一，其含量的测定是重要的疾病诊断和营养评价指标【６】，临床研究发现，一些疾病的发生与人体中ＡＡ含量的变化有密切关系【７，８１。而且，ＡＡ在肥大细胞中也具有非常重要的作用【９，１０］。由于抗坏血酸在碳电极或金属电极上的氧化需要较高的氧化电位，因此在检测过程中易受到其它生物物质的干扰，化学修饰电极（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅＣＭＥ）是集分离、富集和测定３个功能于一体的理想体系，在高选择性和灵敏度方面具有独特的优越性，已有文献报道氨基吡啶【１１１、谷氨酸【１２１、中性红［１３】等被用于修饰电极来测定抗坏血酸。普鲁士蓝（Ｐｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ，ＰＢ）因具有优良的高度的稳定性、电化学可逆性、容易制备等优点，在电催化方面具有相当的应用潜力。纳米级ＰＢ修饰电极也已经用于检澳，ＪＪＨ２０２、葡萄糖以及血红素等。碳纳米管（ｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓ，ＣＮＴｓ）由于其具有独特的中空管状结构、优良的导电和催化活性等性质，在电化学和电分析化学中得到广泛的应用。傅崇剐１４】等制备了一种溶胶一凝胶普鲁士蓝膜修饰玻碳电极，研究了抗坏血酸在该电极上的电催化氧化作用，并将其用于水果中抗坏血酸的测定。Ｋａｒｖａｋｉｎ等【１５，１６】先后通过模板和不用模板在玻碳电极上电沉积ＰＢ，形成纳米微电极用来测定Ｈ２０２，Ｗａｎｇ［１７Ｊ等利用碳纳米管修饰丝网印刷电极在微流控芯片青岛科技大学研究生学位论文上实现了抗坏血酸的催化氧化及多种物质的分离。本文将碳纳米管的高效电催化效应和纳米普鲁士蓝的低电位催化能力结合起来，制得碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰的碳纤维微盘电极，并将其用于微流控芯片单个大鼠腹腔肥大细胞中的抗坏血酸的检测，该法目前尚未见报道。５．２实验部分５．２．１仪器恒温加热磁力搅拌器（ＣＬ．２型，巩义市予华仪器有限公司，巩义，河南）；高速离心机（ＧＤＬ．ＩＯＣ，上海安亭科学仪器厂）；其余同４．２．１５．２．２材料与试剂Ｏ．５％（ｗ／ｖ）台盼兰溶液；称取０．０５ｇ台盼兰（于少量水中，并置于研钵中充分研磨至溶于水，然后用０．２２ｐｍ孔径的过滤器过滤，定容于１０ｍＬ容量瓶中。０．００１ｍｏｌ·Ｌ－１肾上腺素溶液：准确称取０．００９２ｇ肾上腺素（Ｆｌｕｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）于５０ｍＬ小烧杯中，用超声波仪震荡溶解，定容至５０ｍＬ容量瓶中。使用时用缓冲溶液稀释至１０ｍＬ容量瓶中，并用Ｏ．２２ｐｍ孑Ｌ径的过滤器过滤。０．２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钠溶液：准确称取３．１２ｍｏｌ·Ｌ．１磷酸氢二钠溶液：准确称取７．１６ｇＮａ２ＨＰ０４·１２Ｈ２０（上海亨达精细化工有限公司，上海）溶于１００ｍＬ蒸馏水中备用。Ｏ．２ｇＮａｉｌ２Ｐ０４·１２Ｈ２０（天津市博迪化Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６】（天津市瑞金特化学工有限公司，天津）溶于１００ｍＬ蒸馏水中备用。０．０２５ｍｏｌ·Ｌ－１铁溶液：准确称取０．０８２ｇ品有限公司，ＡＲ）溶于水后，用水定容至１０ｍＬ容量瓶中。６．２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１氯化亚铁．０．１２５ｍｏｌ·Ｌ－１聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液：准确称ｇ取Ｏ．１２４ＦｅＣｌ２－４Ｈ２０（天津市瑞金特化学品有限公司，ＡＲ），准确移取１．９４ｍＬＰＤＤＡ，用水定容到１００ｍＬ容量瓶。聚二烯丙基二甲基氯化铵（ｐｏｌｙ（ｄｉａｌｌｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ），ＰＤＤＡ，Ｍｗ＝－１０００００．２０００００ｇ．ｍｏｌ～，２０％水溶液，购自Ａｌｄｒｉｃｈ）。ｃａｒｂｏｎ多壁碳纳米管（ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄｌＯ．２０ｎａｎｏｔｕｂｅｓ，ＭＷＣＮＴｓ，纯度＞９５％，内直径ｎｍ，长度～３０ｎｍ，深圳纳米港有限公司）。ⅣⅣ－２．二甲基甲酰胺（ＤＭＦ，天津瑞金特化学品有限公司，天津）。其它材料及试剂同４．２．２。５５微流控芯片单细胞分析５．２．３实验方法５．２．３．１碳纤维簇微盘电极的制作同３．２．３．１ＭＷＣＮＴｓ的处理ｇ５．２．３．２取Ｏ．５ＭＷＣＮＴｓ力Ｈ入到１００ｍＬ混酸溶液（浓ＨＮ０３：浓Ｈ２Ｓ０４－１：３，ｖ／ｖ）中超声６ｈ，然后用大量二次蒸馏水洗至中性，抽滤。用ｐＨ＝８．９的水洗至滤液ｐＨ－８，以获得负电荷控制的．ＣＯＯ‘。将带有．ＣＯＯ。的ＭＷＣＮＴｓ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离，０３０ｍｉｎ，以除去表面附着物，然后真空干燥。用玛瑙研钵研磨成粉末。取５ｍｇ处理后的ＭＷＣＮＴｓ超声分散到１０ｍＬＤＭＦ中，得到２ｍｇ·ｍＬ。１的碳纳米管悬浮液。每次使用前超声１５ｍｉｎ。５．２．３．３ＰＤＤＡ保护的纳米普鲁士蓝的制备及表征０．０２５实验步骤参照文献【１引，将４ｍＬ态下，缓慢滴加到１６ｍｏｌ·Ｌ－１的Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６】溶液在强力搅拌状ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＤＤＡ混合溶液中，室ｍＬ６．２５ｍｍｏｌ·Ｌ．１ＦｅＣｌ２．０．１２５温状态。这样得到的深蓝色溶液作为ＰＤＤＡ保护的纳米普鲁士蓝（ｐｏｌｙ（ｄｉａｌｌｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ）ｐｒｏｔｅｃｔｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｐ－ＰＢ）储备液，Ｐ．ＰＢ纳米颗粒的平均粒径为２７５．２．３．４修饰电极的制备ｎｒｎ。将自制的碳纤维电极用金相砂纸打磨，再分别在无水乙醇和二次水中超声３ｍｉｎ，然后置于５ｍｍｏｌ·Ｌ－１铁溶液中进行循环伏安扫描，检测电极性能，若氧化还原峰电位差小于８０ｍＶ，则超声清洗后，室温下自然晾干就可进行下一步的修饰。将电极浸在２ｍｇ·ｍＬ。１的碳纳米管悬浮液中２ｍｉｎ，取出晾干，再置于在Ｐ．ＰＢ溶液中浸泡２０ｍｉｎ，取出，电极在每次浸泡操作完成后都要用二次水小心清洗电极表面，室温下自然晾干，备用。５．２．３．５ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥ的处理同３．２．３．２５．２．３．６肥大细胞分离及处理同４．２．３．３５．２．３．７肥大细胞的计数同４．２．３．４５．２．３．８单细胞进样青岛科技大学研究生学位论文芯片通道在每次测定细胞前依次用Ｏ．１０ｍｏｌ·Ｌ～ＮａＯＨ，Ｈ２０各处理５ｒａｉｎ，然后再注入电泳缓冲液分别处理５ｍｉｎ，将处理好的芯片柱端安培检测装置固定在倒置显微镜的载物台上，选择放大倍数为１６０倍。然后移液吸取上述细胞悬浮１０ｐＬ于样品池ｃ中，其余各储液池均加入２．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸缓冲溶液保持各储液池液面相平。在样品池和废液池加１．０ｋＶ的高压，在显微镜下观察到单个细胞在电渗流作用下漂移到通道口，小心移动高压的位置使细胞进入进样通道，然后将高压降为Ｏ．５ｋＶ，待细胞即将运动到双Ｔ点时，迅速将高压电源的正极提离样品池停止加压，这样便导入了单个细胞。全细胞进样的整个过程大约要用３０．１２０ｓ。５．２．３．９细胞的溶膜细胞进入微流控芯片双Ｔ之间的区域待其贴壁（约１．３ｍｉｎ）后，在缓冲液池和检测池加１．０ｋＶ高压，并反复通断，细胞迅速溶膜。当在显微镜下观察到双Ｔ区域内的肥大细胞破膜溶解以后，将各储液池内溶液吸出，加入新鲜的缓冲溶液，在缓冲液池和检测池加１．１ｋＶ高压，进行电泳分离。５．２．３．１０微流控芯片／柱端安培检测同３．２．３．８５．３结果与讨论５．３．１ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ对抗坏血酸的电催化氧化作用将ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ分别在不含ＡＡ和含有ＡＡ的２．００ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ．１的磷酸缓冲溶液（ｐＨ５．０）中做循环伏安曲线，循环伏安图示于图５．１的曲线１，２。图５．１中曲线１为ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ在空白底液中的电化学行为，由图可知，ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ在．Ｏ．２Ｖ．Ｏ．７Ｖ电位范围内出现一对氧化还原峰，这是普鲁士蓝自身的氧化还原信号。曲线２为加入ＡＡ后ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ的电化学行为。由图可知，加入ＡＡ后，循环伏安曲线发生很大变化，氧化电流明显增大，氧化电位基本不变，还原电流相应减小，这表明ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ对ＡＡ的氧化有明显的电催化作用。而通过与图４．１中ＡＡ在裸电极上的电化学行为相比，ＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ／ＣＦＭＢＥｓ的氧化电位降低了大约２００ｍＶ。５７微流控芯片单细胞分析一Ｏ．２０．００．２盘．４０．軎０，ｌＰｏｔｅｎｄａｌ，Ｖ图５－ＩＭＷＣＮＴｓ／Ｐ．ＰＢ修饰碳纤维电极的循环伏安曲线图Ｆｉｇ．５－１ＣｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍｓｏｆＭＷＣＮＴｓ／Ｐ－ＰＢ／ＣＦＭＥｓ１，２．００×１０。２ｔｏｏｌ·Ｌ．１ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．０；２，（１）＋１．００×１０之ｍｏｌ·Ｌ－１ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ５．３．２抗坏血酸检测条件的选择５．３．２．１检测电位的确定在安培检测中，工作电极检测电位的设定直接影响到检测的灵敏度、重现性及检测限，实验中发现抗坏血酸的峰电流的信号总体上呈上升趋势，但是同时噪音信号也增大，综合考虑，．选择信噪比较好的＋Ｏ．４Ｖ为检测电势。５．３．２．２工作电极与通道出口距离的确定在进行微流控芯片泳柱端安培检测时，工作电极与分离通道的出口间的距离大小会影响检测的灵敏度和峰宽，因而决定着分离的效率。研究中发现距离太近，峰电流迅速上升，但分离通道内高压电场对检测短的影响较大，基线噪音大，且容易产生气泡，甚至会造成短路。当工作电极离分离通道末端较远时，抗坏血酸扩散到工作电极所需的时间变长，导致峰形变宽，峰电流减小。为了获得较高的灵敏度和良好的电泳峰，实验中工作电极和通道出口对齐，并且保持１０．２叩ｍ的距离。５．３．２．３缓冲液ｐＨ值及缓冲液浓度的影响综合考虑抗坏血酸和普鲁士蓝膜在检测过程中的稳定性，选用ｐＨ为５．０的磷酸缓冲溶液。同时缓冲液的浓度决定溶液的粘度系数、溶质的扩散系数，从而５８青岛科技大学研究生学位论文会直接影响芯片通道内表面的电位及电渗流，影响样品的迁移时间和峰形，因此选择合适的缓冲液浓度是获得较好电泳条件的关键。随着缓冲溶液浓度的增大，离子强度增强，ｚｅｔａ电势变小，电渗流也相应减小，迁移时间逐渐增长，分离度也会随之增大加，但是缓冲溶液的浓度过高易产生大量的焦耳热，影响电泳分离的重现性。因此实验中，选择２．００ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ－１的磷酸缓冲溶液（ｐＨ５．０）为运行缓冲溶液。５．３．２．４抗坏血酸的典型电泳图综合以上研究结果，确定检测抗坏血酸的检测条件为：ｐＨ测定，１．０ｋＶ进样５Ｓ时，５．０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ．１ＡＡ的电泳示于图５．２。５．０，２．００ｘｌＯ。２ｔ００１．Ｌ－１的磷酸缓冲溶液，缓分离电压为１．１ｋＶ，检测电势为Ｏ．４Ｖ，在此条件下尊露’孕暑０爹０ｌ‘０ｊ１０乞７ｓ图５－２１，ＡＡ的标准溶液的电泳图；２，大鼠腹腔肥大细胞溶膜液的电泳图；Ｆｉｇ．５－２Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ１，５．００ｘｌＯ‘５ｍｏｌ‘Ｌ－１ＡＡ；２，ｔ１１ｅｅｘｔｒａｃｔｏｆｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓ；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ２．００×１０－２ｍｏｌ·Ｌ·ｌｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．Ｏ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，１．１ｋＶ；ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，０．４Ｖ（ｗ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）；ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，１．０ｋＶｘ５Ｓ．５．３．２．５抗坏血酸的线性范围、检测限及重现性为了使分析结果更加准确，我们用峰面积曰来定量溶液样品中抗坏血酸的量。配制一系列不同浓度的ＡＡ的标准溶液，在以上优化的条件下，得到不同浓度下峰电流ｉｐ值，半峰宽％／２，以１９ｃ对１朗作图，结果示于图５—３。得到了ＡＡ组分的线性范围（８．ＯｘｌＯ－７＿５．０ｘ１０‘４ｍｏｌ·Ｌ－１），线性回归系数为０．９９８１，并以电泳峰电流与噪声比值（ｓｉｎ）为３时得到浓度检测限２．７×１０～ｍｏｌ·Ｌ．１。５９微流控芯片单细胞分析．７．０－７．５奇‘８．０ｂＤ．８．５．９．０－６．５·６．０－５．５—５．Ｏ—４．５—４．Ｏ一３．５－３．０ｌｇｃ图５－３抗坏血酸的ｑ（Ｃ）与Ｃ（ｍｏｌ‘ＬＪ）的对数关系图Ｆｉｇ．５－３ＳｔａｎｄａｒｄｗｏｒｋｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆｌｇｑｔｏｌｇｃＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：２．００×１０ｑｍｏｌ‘Ｌ叫ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．Ｏ；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．５－．２由抗坏血酸的进样体积为Ｏ．３４ｎＬ可知，质量检测限为０．０９ｆｍｏｌ。将ＡＡ（５．００ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ．１）标准溶液连续进样７次，得‰和ｉｐ的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为０．５７％和２．１％。５．３．３肥大细胞提取液中抗坏血酸含量的检测５．３．３．１定性吸取已准确定容的肥大细胞测定液１ｍＬ在最佳条件下进行测定微流控芯片柱端安培检测，得到的电泳图示于图５．２曲线２。在相同条件下所作的标准抗坏血酸溶液电泳示于图５．２曲线１。由两曲线对比可看出，在肥大细胞测定液中的电泳峰与标准抗坏血酸溶液的电泳峰有相同的迁移时间。而且由溶膜液加标回收率的实验测定结果图５－４可以看出，在肥大细胞测定液中加入一定量的抗坏血酸，所得电泳图（图５－４中曲线２．４）与图５．２曲线１比对，发现迁移时间没有变化，电泳峰明显升高，但峰宽没有增大。因此可以确定图５．４曲线２中的电泳峰为抗坏血酸产生。５．３．３．２定量及回收率取１ｍＬ肥大细胞测定液，用标准曲线法定量得到ＡＡ浓度为３．２ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１，通过肥大细胞预处理时的细胞计数，已知肥大细胞浓度为５．７ｘ１０５ｃｅｌｌ．ｍＬ－１，因此可计算出单个肥大细胞中的ＡＡ平均含量为５．６ｆｉ＇ｎｏｌ。青岛科技大学研究生学位论文ＡＡＡＡＡＡ４髹’０９０；０１００１１０≮ｓ乞’ｓ乞’ｓｔｊＳ图５＿４肥大细胞溶膜液回收率Ｆｉｇ．５－４ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆｍａｓｔｃｅｌｌｅｘｔｒａｃｔｗｉｔｈｏｕｔａｎｄｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆＡＡ．ＴｈｅａｄｄｅｄｃｏｎｃｅｎｌｒａｔｉｏｎｏｆＡＡ：（１）Ｏ；（２）５．００ｘ１０石ｍｏｌＬｌ；（３）１．００ｘ１０。５ｍｏｒＬｌ；（４）３．００ｘ１０‘５ｍｏｌ。Ｌ～．ａｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：２．００×１０。ｍｏｌ‘Ｌ－１ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．０；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅＦｉｇ．５－２．用标准加入法测定的电泳图示于图５４中，回收率的计算结果列于表５．１中，回收率在９８．９９％之间，说明该方法准确可靠。表５．１ＡＡ标加法测定值及回收率结果Ｔａｂ．５－１ＴｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆＡＡＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：２．００ｘｌ０。２ｍｏｌ’Ｌ’１ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．Ｏ；ａｓｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅＦｉｇ．５—２．５．３．４单个大鼠肥大细胞中抗坏血酸含量的测定５．３．４．１单个大鼠腹腔肥大细胞细胞活性的检测取一滴细胞悬浮液加入一滴Ｏ．５％（ｗ／ｖ）台盼兰溶液检验细胞活性。不着色的为活细胞，变蓝色的为死细胞。显微镜下观察，细胞约９５％存活。细胞呈圆形，６１微流控芯片单细胞分析细胞膜光滑。当放置一段时间后，细胞活性有所降低。此时未染色的活细胞中有一小部分细胞的细胞膜周边已不光滑，这可能是细胞发生自发脱颗粒现象。这就要求细胞分离后细胞必须在较短的时间内使用。５．３．４．２定性两个单个大鼠肥大细胞的电泳如图５．５曲线２，３所示。曲线２，３中在８５ｓ处的有电泳峰，与在相同条件下检测５．ＯｘｌＯ巧ｍｏｌ＋Ｌ－１标准ＡＡ所得的电泳峰（如曲线ｌ所示）的迁移时间一致，由此判断该峰是单个大鼠肥大细胞中ＡＡ的峰。▲▲２３‘ｏ。孑ｏ。—。而’而。ｌ石ｏ’１１。ｏｏｓ图５－５单个肥大细胞电泳图Ｆｉｇ．５．５Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ（１）５．００ｘｌＯ。５ｍｏｌ。Ｌ．１ＡＡ；（２），（３）ｔｈｅｓｉｎｇｌｅＲＰＭＣ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：２．００×１０吐ｍｏｌ。Ｌ“ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨ５．Ｏ；ｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．５－２５．３．４．３定量由于单细胞的体积很小，单细胞内含有的组分的浓度一般很低，当检测单细胞的内含物时，采用常用的内标法或标准加入法进行定量测定是很困难的。因为要引入内标物，势必要造成细胞内组分浓度的稀释，要控制稀释就必然需要许多复杂的微量操作。因此通常是用工作曲线法进行定量。采用峰面积及绝对质量工作曲线法定量。ＡＡ的绝对质量与峰面积的关系示于图５．６。由图５－６得出ＡＡ的线性范围为Ｏ．２７．１７０ｆｍｏｌ，线性回归系数为０．９９８１。连续测定９个肥大细胞，测得的单个肥大细胞抗坏血酸的含量以及运行次数与迁移时间的关系示于表５．２。６２青岛科技大学研究生学位论文．７．０．７．５专一８．０ｂ０．８．５．９．０一１６．０一１５．５－１５．Ｏ—１４．５－１４．０—１３．５一１３．０－１２．５ｌｇＭ图５－６抗坏血酸的ｇ（Ｃ）与绝对质量Ｍ（ｍ０１）的对数关系图Ｆｉｇ．５－６ＳｔａｎｄａｒｄｗｏｒｋｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆｌｇｑｔｏｌｇＭ５．０；Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：２０ｍＭｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｐＨｏｔｈｅｒｓｔｈｅｓａｍｅａＳＦｉｇ．５－２表５．２单个大鼠腹腔肥大细胞运行次数与抗坏血酸‰、ｇ及Ｍ的关系Ｔａｂ．５－２Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｔｉｍｅｓｔｍ、ｑ－ａｎｄＭＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｔｈｅｓａｍｅａｓＦｉｇ．５－２．实验中发现，随着测定单细胞运行次数的增加，ＡＡ的迁移时间略有增加，这主要是细胞破膜后，残余的膜碎片以及细胞内的蛋白附着于芯片通道内壁造成电渗减小导致的。这一现象在文献［１９１中已有报道。为了提高检测的准确度，减少细胞在芯片通道内的贴壁时间，每进行一次单细胞检测后，都对芯片通道进行清洗。６３微流控芯片单细胞分析这样大大提高了细胞内ＡＡ迁移时间的重现性。测得单个肥大细胞中ＡＡ的含量为２．５．７．３ｆｍｏｌ。单个肥大细胞之间ＡＡ含量差别较大，不能用取样或测量误差来解释，主要是由于细胞的体积不同，年龄不同以及与细胞内其他组分结合状态不同造成的。５．４结论采用微流控芯片柱端安培检测方式，以自制的碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰的碳纤维微盘电极为工作电极检测抗坏血酸，降低了抗坏血酸的检测限，线性范围为８．Ｏ×ｌＯ。‘．５．Ｏ×１０’４ｍｏｌ·Ｌ～，实现了单个大鼠肥大细胞中抗坏血酸含量的测定。单个肥大细胞之间ＡＡ含量差别较大，不能用取样或测量误差来解释，主要是由于细胞的体积不同，年龄不同以及与细胞内其他组分结合状态不同造成的。青岛科技大学研究生学位论文参考文献［１】ＭｃｃｌａｉｎＭＡ．，ＣｕｌｂｅｒｔｓｏｎＣ．Ｔ．，ＪａｃｏｂｓｏｎＳ．Ｃ．，ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＤｅｖｉｃｅｓｆｏｒｔｈｅＨｉｇｈ－ＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＣｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｅｌｌｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００３，７５：５６４６－５６５５【２】ＳｃｈｉｌｌｉｎｇＥ．Ａ．，ＫａｍｈｏｌｚＡ．Ｅ．，ＹａｒＰ．，ＣｅｌｌＬｙｓｉｓａｎｄＰｒｏｔｉｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎｆｌａｎｄｍｉｃｒｏｃｈｉｐｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃ．ｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ，２００２，２３：３６５９－３６６６［３】ＧａｏＪ．，ＹｉｌｌＸ．Ｆ，ＦａｎｇＺＬ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｌｙｓｉｓ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｎａｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｃｈｉｐ［Ｊ］，Ｌａｂｏｎａｃｈｉｐ，２００４，４：４７．５２【４】ＨｕａｎｇＷ．Ｈ．，ＣｈｅｎｇＷ．，ＺｈａｎｇＺ．，ＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃＰｏｉｎｔＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＮｏｒｏｖｉｒｕｓＶｉｒｕｓ－ｌｉｋｅＰａｒｔｉｃｌｅｓｂｙＣａｐｉｌｌａｒｙＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇｗｉｔｈＷｈｏｌｅＣｏｌｕｍｎＩｍａｇｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＡｎａＬＣｈｅｍ．，２００４，７６：４８—５２［５】ＷｈｅｅｌｅｒＡ．Ｒ．，ＴｈｒｏｎｄｓｅｔＷ．Ｒ．，ＷｈｅｌａｎＲ．Ｊ．，ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＤｅｖｉｃｅｆｏｒＳｉｎｇｌｅ－ＣｅｌｌＡｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，２００３，７５：３５８１－３５８６【６】ＡｎｄｒｅｉＦ．，Ｄ氲ｎｅｔＭ．Ｂ．，ＨａｓｓａｎＹ．，ｅｔ．ａｌ，Ｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｎｚｙｍｅｔｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ［Ｊ］，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，２０００，１５：３０５－３０９［７］ＧｈａｓｅｍｉＶ．，ＲａｏｏｆＪ．Ｂ．，ｏｊａｎｉＲ．，ｅｔ．ａｌ，Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｏｎａｆｅｒｒｏｃｅｎｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ—ｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂｏｎｐａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，ＢｕｌｌＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．，２００５，２１：１１５．１２２【８】ＭｏｈａｍｍａｄＫ，Ａ．，ＳａｉｄＳ．，ＳｈａｈｒａｍＴ．，ＰＶＣ—ｂａｓｅｄＭｎ（ＩＩＩ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｍｅｍｂｒａｎｅ－ｃｏａｔｅｄｇｒａｐｈｉｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｉｓｔｉｄｉｎｅ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９９９，７１：２５０２－２５０５［９】ＥｌｌｉｏｔｔＭ．，ＣｈｉｔｈａｎＫ，ＴｈｅｏｈａｆｉｓＣ．Ｔ．，Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｌａｎｔｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｏｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ，ａｎｄｃａｎｃｅｒ［Ｊ］，ＰｈａｒｍａｃｏｌＲｅｖ．，２０００，５２：６７３．７５１［１０】ＳｅｒｇｅｙＰ．，ＡｌｅｘａｎｄｅｒＭ．，ＭｙｒｏｎＷ．，Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃａｓｓａｙｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙｏｎｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００１，４３：１９９－２０３【１ｌ】吴婧，刘国东，黄杉生等，乙．２一氨基吡啶修饰电极的电化学性质及对抗坏血酸的测定【Ｊ】，分析化学，２００１，２９（１０）：１１４０－１１４３［１２］ＹｕＡｉｎｕｎ，ＣｈｅｒｔＨｏｎｇｙｕａｎ．Ｅｌｅｃｔｒｃａｔａｌｙｔｉｃｏｘｉｄａｔｉｏｎａｍｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄａｔｐｏｌｙ（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ［Ｊ］，Ａｎａ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，３４４（３）：１８１—１８５［１３】ＳｕｎＹ．ｘ．，ＹｅＢ．Ｘ．，ＺｈａｎｇＷ．，ｅｔａ１．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅａｎｄａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄａｔｐｏｌｙ（ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄ）ｍｏｄｉｆｉｅｄｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ［Ｊ】，Ａｎａ．Ｃｈｈｎ．Ａｃｔａ，１９９８，３６３：２７５－２８０【１４］张贵贤，傅崇岗，基于溶胶．凝胶普鲁士蓝膜修饰玻碳电极电催化氧化测定水果中抗坏６５微流控芯片单细胞分析血酸［Ｊ】，理化检验一化学分册，２００７，４３：２６０－２６３【１５］ＫａｒｙａｋｉｎＡ．Ａ．，ＰｕｇａｎｏｖａＡｒｒａｙｓｆｏｒＨ２０２Ｅ．Ａ．，ＢｕｄａｓｈｏｖＩ．Ａ．，ｅｔａｌ，ＰｒｕｓｓｉａｎＢｌｕｅＢａｓｅｄＮａｎｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ】，ＡｎａｌＣｈｅｍ，２００４，７６（２）：４７４＿４７８ｏｎ【１６】ＰｕｇａｎｏｖａＥ．Ａ．，ＫａｒｙａｋｉｎＡ．Ａ．，ＮｅｗｍａｔｅｒｉａｌｓｂａｓｅｄｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｓｅｎｓｏｒｓ［Ｊ］，Ｓｅｎｓｏｒｓ＆Ａｃｔｕａｔｏｒｓ：Ｂ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ，２００５，１０９（１）：１６７—１７０［１７］ＷａｎｇＪ．，ＣｈｅｎＧ．，ＭａｄｈｕＰ．Ｃ．，ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＭｉｃｒｏｃｈｉｐ诵ｔｈａＣａｒｂｏｎＮａｎｏｔｕｂｅ—ＭｏｄｉｆｉｅｄＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００４，７６：２９８－３０２［１８］ＺｈａｏＷ．，ＸｕＪ．Ｊ．，ＳｈｉＣ．Ｇ．，ＭｕｌｔｉｌａｙｅｒＭｅｍｂｒａｎｅｓｖｉａＬａｙｅｒ－ｂｙ—ＬａｙｅｒＤｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＯｒｇａｎｉｃＰｏｌｙｍｅｒＰｒｏｔｅｃｔｅｄＰｒｕｓｓｉａｎＢｌｕｅＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｎｄＧｌｕｃｏｓｅＯｘｉｄａｓｅｆｏｒＧｌｕｃｏｓｅＢｉｏｓｅｎｓｉｎｇ［Ｊ］，Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００５，２１：９６３０—９６３４【１９】ＪｉｎＷ．，ＬｉＷ．，ＸｕＱ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎｓｉｎｇｌｅｈｕｍａｎｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｚｏｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｍｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｉｓｉｓ，２０００，２１：７７４－７７９青岛科技大学研究生学位论文第六章微流控芯片电化学发光检测器的研究６．１引言９０年代由瑞士的Ｍａｎｚ等提出了以微机加工技术（ＭＥＭＳ）为基础的“微型全分析系统’’（Ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ，ｐＴＡＳ）１１Ｊ。ＩａＴＡＳ的目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度地把分析实验室的功能转移到便于携带的分析设备中，甚至集成到方寸大小的芯片上，所以又称为芯片实验室（Ｌａｂ—ｏｎ—ａ－ｃｈｉｐ）。微芯片毛细管电泳（ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＭＣＣＥ）作为ｌａＴＡＳ的一个重要领域，它集中体现了将分析实验室的功能转移到芯片上去的思想，具有分析速度快、信息量高、操作费用低、样品消耗小等突出优点，所以成为ｐＴＡＳ中当前最活跃的领域和发展前沿，引起了人们极大的兴趣【２训。与传统的毛细管电泳相比，ＭＣＣＥ的进样量更小，因而对与其联用的检测器要求更高。紫外．可见吸收（ｕｖ）检测法是传统毛细管电泳的一种常用的检测器”Ｊ，但由于其检测限高，很难满足微流控芯片微小进样量分析的要求。激光诱导荧光和质谱检测器具有很高的灵敏度，但也存在一些不足，如采用激光诱导荧光检测分析组份需要衍生，并且这两种检测器的造价昂贵，从而了微流控芯片的广泛使用。电化学检测方法具有灵敏度高、仪器简单、价格便宜、易于微型化等优点，近来发展非常迅速【６＇７Ｊ。但电化学检测也有一些不足，如安培检测容易受到毛细管电泳高压电场的影ｕｌｊｊ［ｓ，１０】，另外，工作电极的表面容易受到沾污，从而影响检测的稳定性和重现性。所以，发展新型稳定的适合于微流控芯片的检测器是一个重要的课题。Ｔｏｋｅｌ并－ＩＢａｒｄ［１１】首先报道了Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光技术，并引起人们的关注。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的电化学发光检测是一种非常有前途的检测方法，它具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽等优点【１２，１３】，因而ＥＣＬ检测己与液相色谱【１４１，流动注射【１５】等检测器联用，用于对丙酮酸【１６１、氨基酸‘１７１、草酸【１８１、ＮＡＤＨ和葡萄糖【１９】和核酸［２０】的检测。由于ＥＣＬ是在电极表面产生的化学发光反应，在电化学发光反应中只消耗极少量的反应物，因此这种模式非常适合于微流控芯片采样体积少的特点。ＥＣＬ与ＣＥ技术的联用已有报道【２１，２２１，但ＥＣＬ与ＭＣＣＥ联用却很少【２３】。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它是人和动物体内参与氧化还原代谢的一种重要的三肽，参与活性细胞中的许多生物过程。作为生物体内的非蛋白巯基化合物，谷胱甘肽主要有还原型（ＧＳＨ）和氧化型（ＧＳＳＧ）谷胱甘肽两种形态，在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽，其分子结构见图６．１。它具有清除自由基、解毒、抗病毒、抗肿瘤、保护肝脏、促进铁质吸收及维持红细胞的完６７微流控芯片单细胞分析整性、维持ＤＮＡ的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能【２４】，因此，研究ＧＳＨ在医药、食品等领域中具有十分重大的意义。至今已有大量文献介绍关于谷胱甘肽的检测，方法多种多样，有化学滴定法、分光光度法、高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）等。但是上述各类分析方法，由于方法本身灵敏度较低，受干扰因素较多，只能局限于某类样品的分析，缺乏应用的普遍性无法在实际中推广普及。ＳＨＩｒＬ————、，—ＪＹ一谷氨酸ｆＨ２Ｌ——Ｙ——ＪＨ２ＮＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＯ——一ＮＨＣＨＣＯ——。卟州ＣＨ２ＣＯＯＨＬ———、———Ｊ半胱氨酸图６－１ＧＳＨ的化学结构甘氨酸Ｆｉｇ．６．１ＣｈｅｍｉｃａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＧＳＨ本文设计了一种集成化微芯片毛细管电泳电化学发光检测系统，以ＰＤＭＳ／玻璃作为芯片材料，碳纤维簇微盘电极为工作电极，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋作为发光试剂，首次将Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋ＭＣＣＥ．ＥＣＬ技术用于谷胱甘肽的分析，并初步研究了该方法的可行性。６．２实验部分６．２．１仪器ＭＰＩ．Ｍ型微流控芯片化学发光分析系统电化学分析仪、ＭＰＩ．Ｍ型微流控芯片化学发光分析系统数控多路高压电源（西安瑞迈分析仪器有限公司）。高压电源输出为４路，每路输出电压量程为０．２０００其余同３．２．１Ｖ；６．２．２材料与试剂弹性石英毛细管（内径２５ｐｍ，外径３７５ｐｍ，河北永年光导纤维厂）碳纤维（直径６ｌａｍ，山东工业大学碳纤维研究中心）Ｏ．２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氢钠溶液：准确称取３．１２ｇＮａｉｌ２Ｐ０４－２Ｈ２０（上海亨达精细化工有限公司，ＡＲ）溶于１００ｍＬ亚沸蒸馏水中备用Ｏ．２ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸氢二钠溶液：准确称取７．１６ｇＮａａＨＰ０４＂１２Ｈ２０（天津市博迪化工有限公司，ＡＲ）溶于１００ｍＬ亚沸蒸馏水中备用青岛科技大学研究生学位论文１．０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１谷胱甘肽（索莱宝科技有限公司，北京）：准确称取０．００７７谷胱甘肽用亚沸蒸馏水溶解定容于２５ｍＬ容量瓶中１．Ｏ×１０～ｍｏｌ·Ｌ－１三联吡啶钌（ＡｌｆａＡｅｓａ，ＪｏｈｎｓｏｎｇＭａｔｔｈｅｇＤｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）：准确称取０．２１３６ｇ三联吡啶钌用亚沸蒸馏水溶解定容于５０ｍＬ容量瓶中所有的试剂和运行缓冲溶液在４℃冰箱保存，在使用前均经过０．２２ｐｍ聚丙烯滤膜过滤。６．２．３实验方法６．２．３．１电化学发光检测池的制作微流控芯片电化学发光检测池外型如图６．２所示，模板所用的材料是有机玻璃板１，在长２．５ｃｍ宽１．８ｃｍ厚度８ｍｌＴｌ的有机玻璃板一侧的位置用电钻打孔作为检测池２（孔径Ｏ．５ｃｍ），在如图６．２所示３和４的位置上钻孑Ｌ分别插入两根外径５００ｌｌｍ，长约１．５ｃｍ的铂丝用作高压负极和辅助电极，铂丝的末端用手工圈制成铂丝圈，平铺在检测池１的底部。在有机玻璃板５的位置上打一个直径０．５ｃｍ，深０：６ｃｍ的洞作参比电极池，用以放置参比电极，并且在５和２之间打孔以使两池相同。图６－２电化学发光检测池Ｆｉｇ．６－２ｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｏｆＥＣＬ１．有机玻璃板；２．检测池；３．高压负极；４．辅助电极；５参比电极池；ｃｅｌｌ；６，ｉｎｄｕｃｔｉｎｇｍｂｅ６引导管ｌ，ｐｌｅｘｉｇｌ舔ｓｂｌｏｃｋ；２，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；３，ｃａｔｌｌｏｄｅ；４，ａｕｘｉｌｉａｒｙｅｌｅｃ仃ｏｄｅ；５，ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｌｅｃ仃ｏｄｅ然后将一根一次性注射器（５ｍＬ）的６．５号钢管针头（外径６８０ｐｍ，内径３８５ｐｍ，长２．５ｅｍ）用ＧＪ．３０１型环氧树脂固定在如图６．２所示６的位置上作引导管，用来固定微流控芯片单细胞分析自制的碳纤维簇微盘工作电极，使用时，将电极插入到引导管中，在显微镜的视野下观察使之与微流控芯片的出口端对齐，即可用于微流控芯片柱端安培检测。６．２．３．２ＰＤＭＳ芯片的构造同３．２．３．２。６．２．３．３微流控芯片电化学发光检测系统的制作微流控芯片电化学发光检测器的实验装置如图６．３所示，将一长６．８ｃｍ，宽２．８ｃｍ，厚２ｍｍ的透明玻璃片７和做好的三电极检测池用ＡＢ胶粘合在长３．０ｃｍ，宽３．０ｃｍ，厚２．０ｍｍ的透明玻璃片８上，保证玻璃片末端和三电极检测池端相切且位于小玻璃片，并要求检测池中无ＡＢ胶可透光（能够放到暗盒中发光池内满足实验要求），然后固定在一空白磁带盒的底部。将ＰＤＭＳ芯片粘贴到玻璃片７上，使之与玻璃片检测端相切。将工作电极插入到引导管中，借助于显微镜调整电极的位置使之与分离通道出口端对齐并保持一定的距离（￣４０ｐＩｎ）。用一次性注射器将运行缓冲液注于ａ，ｂ池中，ｃ中注入样品，检测池中加Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋。将ＰＤＭＳ的分离通道用缓冲液充满，随后将检测池２中充满电泳缓冲液即可进行电化学发光检测。Ｔ３．０ｃｍｉ图６．３微流控芯片电化学发光检测系统ａ．缓冲液池；ｂ．样品废液池；ｃ．样品池；ｄ．检测端；１有机玻璃板；２．检测池；３。高压负极；４．辅助电极；５．弓ｌ导管；６．参比电极池；７，８．玻璃片Ｆｉｇ．６—３Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｒｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｉｃｒｏｃｈｉｐａ，ｂｕｆｆｅｒｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｂ，ｓａｍｐｌｅｗａｓｔｅｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｃ，ｓａｍｐｌｅｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；ｄ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｅｒｖｏｉｒ．１，ｐｌｅｘｉｇｌａｓｓｂｌｏｃｋ；２，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｅｒｖｏｉｒ；３，ｃａｔｈｏｄｅ；４，ａｕｘｉｌｉａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；５，ｉｎｄｕｃｔｉｎｇｔｕｂｅ；６，ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｄｃｅｌｌ；７，８，ｇｌａｓｓｂｌｏｃｋ６．２．３．４ＰＤＭＳ芯片的封装同３．２．３．４。６．２．３．５碳纤维簇微盘工作电极的制作同３．２．３．５７０青岛科技大学研究生学位论文６．２．３．６碳纤维簇微盘工作电极的处理同３．２．３．６６．２．３．７电泳过程实验中电泳缓冲液采用１．６８ｘ１０之ｔｏｏｌ·Ｌ．１Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａｉｌ２Ｐ０４（ｐＨ－７．４）。在使用前，芯片的通道依次用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＯＨ，超纯水，缓冲液超声１５ｍｉｎ，５ｍｉｎ和３０ｍｉｎ。实验中采用外加的Ｐｔ丝把缓冲液池、样品池与高压电源相连通，检测池接地。在三个储液池中，其中一个在本实验中没有用到，但加入了电泳缓冲液使各储液池保持平衡。在进样时，在样品池和检测池之间施加１．０ｋＶ高压，其余与高压断开并保持５秒；分离时，在缓冲液池和检测池之间施加高压１．２ｋＶ，其余与高压断开。在第一次进样的时候，加电压稍长的时间（～１０ｓ），以保证样品溶液充分进入分离通道，以后的进样时间为５Ｓ。工作电极的电势均相对于Ａｇ／ＡｇＣｌ参比电极。６．２．３．８ＥＣＬ检测在芯片的检测池中，加入５０ｐＬ１．６８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ～Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０ｘ１０一ｔｏｏｌ·Ｌ－１ＮａＨ２Ｐ０４（ｐＨ＝７．４）缓冲液，并含有５．００ｘ１０’４ｍｏｌ·Ｌ－１Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋。采用三电极体系，工作电极为碳纤维簇微盘电极，Ａｇ／ＡｇＣｌ（饱和ＫＣｌ溶液）为参比电极，Ｐｔ丝为对极。光电倍增管（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｔｕｂｅ，ＰＭＴ）的电压为７５０Ｖ。６．３结果与讨论６．３．１谷胱甘肽的循环伏安特性在ｐＨ－７．４，１．６８ｘ１０之ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０×１０～ｍｏｌ·Ｌ．１Ｎａｉｌ２Ｐ０４缓冲体系中做循环伏安曲线，循环伏安图如图６－４中。曲线１是１．６８ｘ１０。２ｍｏｌ·Ｌ＿Ｎａ２ＨＰ０４—３．８０ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ～Ｎａｉｌ２Ｐ０４缓冲液的循环伏安曲线；曲线２是在１．６８ｘ１０呓ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０ｘｌＯ～ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａｉｌ２Ｐ０４缓冲液条件下１．００ｘ１０一ｍｏｌ·Ｌ．１谷胱甘肽的循环伏安曲线。比较图中两条曲线可以看出，曲线１和２中都没有明显的的峰电流信号，由此说明谷胱甘肽在碳纤维工作电极上不具有电化学活性，不能用电化学方法直接检测。７１微流控芯片单细胞分析２－Ｕ．）０．００．５１．１３１．ｊ纛辩、图６＿４谷胱甘肽的循环伏安曲线图Ｆｉｇ．６－４Ｃｕｒｖｅｓｏｆｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ１。１．６８ｘ１０—２ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４—３．８０ｘ１０。ｍｏｌ·Ｌ．１Ｎａｉｌ２Ｐ０４ｐＨ７．４２，（１）＋１．００ｘ１０。３ｍｏｌ·Ｌ－１ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ６．３．２谷胱甘肽电致化学发光的机理．谷胱甘肽与发光试剂Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋作用产生电化学发光有两种机理，一种是Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在检测池被工作电极氧化成Ｒｕ（ｂｐｙ）３”，同时在样品池Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋与ＧＳＨ反应生成Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋和氧化形谷胱甘肽。Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋和Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋反应生成激发态的Ｒｕ（ｂｐｙ）３２妒，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＊返回到基态发光。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋－ｅ—Ｒｕ（ｂｐｙ）３３十Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ＧＳＨ—Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋ＧＳＳＧＲｕ（ｂｐｙ）３３＋＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋＿Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋。＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２ｐ一．Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ｈｖ另一种机理是Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在电极上失去一个电子生成Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋，Ｒｕ（ｂｐｙ）３＂与谷胱甘肽反应产生激发态Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋’并发光。由于谷胱甘肽在碳纤维簇微盘工作电极上的电化学活性极其微弱，因此本实验采用后一种机理。Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋．ｅ－÷Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３３＋＋ＧＳＨ—Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋ＧＳＳＧＲｕ（ｂｐｙ）３３＋＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３＋＿Ｒｕ（ｂｐｙ）ｓ２ｐ＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋‘＿Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋＋ｈｖ７２青岛科技大学研究生学位论文６．３．３谷胱甘肽检测条件的选择６．３．３．１微芯片检测端与电极的距离对电化学发光强度的影响根据电化学发光反应机理，微芯片检测端与电极的距离是影响电化学发光强度及分辨率的一个非常重要的因素【２５１。在微流控芯片电化学发光检测中，由于Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋存在于检测池中，在电化学发光过程中，除了Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋在电极上氧化，分析物也将被电极所氧化，同时在微芯片检测端与工作电极之间的Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋的浓度将会被电泳流出液所稀释。实验发现，当距离太小时，基线噪音大且工作电极周围和通道内易产生气泡，但太大的间距导致了分析物流入到检测区域的物质的量大大下降，发光信号减小。实验中我们选取芯片检测端与电极的距离为４０ｐｍ，每次调整距离的偏差不超过±２ｐｍ。６．３．３．２缓冲液种类缓冲溶液直接影响粒子的迁移和分离。我们分别考察了Ｎａｉｌ２Ｐ０４．Ｎａ２ＨＰ０４缓冲体系、ＮａＥＢ４０７缓冲体系和ＢＲ缓冲体系，Ｎａｉｌ２Ｐ０４．Ｎａ２ＨＰ０４缓冲体系的分离效果较好，因此选用Ｎａｉｌ２Ｐ０４．Ｎａ２ＨＰ０４缓冲液。６．３．３．３缓冲液的ｐＨ值研究中发现，当缓冲液的ｐＨ为７．４时，谷胱甘肽发光信号强度最大且信号稳定，因此选择缓冲液的ｐＨ值为７．４的１．６８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ—ＮａｚＨＰ０４．３．８ｘｌＯ。３ｍｏｌ·Ｌ．１改变缓冲液浓度，谷胱甘肽的发光信号强度、基线噪音都会改变。实验中选ＮａＥＨＰ０４．３．８０ｘｌＯ—ｍ０１．Ｌ．１ＮａＨ２Ｐ０４作为缓冲液浓度，此时，在不同分离电压圪下测定发光信号强度，随分离电压增大，发光信号强度增ｋＶ为最佳分离电压。固定进样条件和分离条件，改变检测电势，可知随检测电势升高，发光信号强度是逐渐增大的，但是同时噪音信号也呈上升趋势，因此选择信噪比较好的１．３７３ＮａＨ２Ｐ０４的缓冲液。６．３．３．４缓冲液浓度择１．６８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１光信号强度值最大，基线噪音较小。６．３．３．５分离电压的影响大，同时基线噪音增大。综合考虑，选择１．２６．３．３．６检测电势微流控芯片单细胞分析Ｖ作为检测电势。６．３．３．７Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋浓度的影响随着Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋浓度的增加，发光信号的强度不断增强，与此同时，基线噪声也随之增大。我们发现Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋浓度为１．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１时得到的信噪比较好。因此，我们选择１．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋作为最佳浓度。６．３．３．８谷胱甘肽的典型发光图谷胱甘肽最佳检测条件为：缓冲溶液为ｐＨ＝７．４的１．６８ｘ１０之ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０ｘｌＯ—ｍｏｌ·Ｌ—Ｎａｉｌ２Ｐ０４磷酸缓冲溶液，检测池内为５０１．６８ｘ１０～ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４—３．８ｘ１０。３ｐＬｐＨ＝７．４的ｍｏｌ·Ｌ～Ｎａｉｌ２Ｐ０４缓冲液，并含有１．０ｘ１０珥Ｖ。ｍｏｌ·Ｌ－１Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋，分离电压为１．２ｋＶ，检测电势为１．３Ｖ，ＰＭＴ高压为７５０在此条件下测定，１．０ｋＶ进样１０ｓ时１．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ－１谷胱甘肽的发光图示于图６．５。６０８０ｏｓ图６．５ＧＳＨ的标准溶液的电泳图Ｆｉｇ．６－５Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍｓｏｆ１．００ｘｌ０４ｍｏｌ＋Ｌ。１ＧＳＨＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：１．００ｘ１０４ｍｏｌ‘Ｌ一１Ｒｕ（ｂｐｙ）ｓ２＋；１．６８×１０。２ｍｏｌ·Ｌ－１Ｎａ２ＨＰ０４．３．８０×１０一ｍｏｌ·Ｌ．１ＮａＨ２Ｐ０４（ｐｎ７．４）；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ，１．２ｋＶ；ｄｅｔｅｃｔｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ，１．３Ｖ；ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，１．０ｋＶｘｌ０ｓ６．３．３．９谷胱甘肽检测的重现性在最佳条件下，１．０ｋＶ进样１０ｓ时，对１．０ｘ１０４ｍｏｌ·Ｌ．１谷胱甘肽连续进样７次，得到ｆｍ和，的相对标准偏差（ＲＳＤ）分别为Ｏ．９２％和２．１％。说明本文采用的自制微流控芯片电化学发光检测系统性能稳定可靠，可以用于进一步的研究工作。７４青岛科技大学研究生学位论文６．４结论本文用自组装的微流控芯片电化学发光检测系统，以自制的碳纤维簇微盘电极为工作电极，选用具有电化学发光活性的谷胱甘肽作检测样品，考核了检测系统的性能，初步研究了影响谷胱甘肽检测的芯片电化学发光条件。实验证明该检测系统运行稳定可靠，为下一步更深入的微流控芯片电化学发光的研究及单细胞中谷胱甘肽的检测工作打下了较好的基础。７５微流控芯片单细胞分析参考文献ＭａｎｚＮ．，ＷｉｄｍｅｒＨ．Ｍ．，Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｔｏｔａｌｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｎｏｖｅｌｓｅｎｓｉｎｇ［Ｊ］，Ｓｅｎｓ．彳ｃ如以幻坶Ｂ．，１９９０，ｌ：２４４－２４８Ｄ．，ＭａｎｚＡ．，ｅｔ．ａｌ，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ１．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａ．，Ｇｒａｂｅｒｃｏｎｃｅｐｔｆｏｒｃｈｅｍｉｃａｌ【２】ＲｅｙｅｓＤ．Ｒ．，ＩｏｓｓｉｆｉｄｉｓＴｈｅｏｒｙ，ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］，ＡｎａＬＣｈｅｍ．，２００２，７４：２６２３·２６３６［３】ＨａｒｒｉｓｏｎＤ．Ｊ．，ＦｌｕｆｆＫ，ＭａｎｚＡ．，ｅｔ．ａｌ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇｏｎａａｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ｂａｓｅｄｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍｃｈｉｐ［Ｊ］，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３，２６１：８９５—８９７Ａｎａｌｙｓｉｓ［４］ＡｕｒｏｕｘＰ．Ａ．，ＩｏｓｓｉｆｉｄｉｓＤ．，ＭａｎｚＳｔａｎｄａｒｄＯｐｅｒａｔｉｏｎｓＡ．，ｅｔ．ａｌ，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＳｙｓｔｅｍｓ：２，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００２，７４，：２６３７—２６５２Ｊ．Ｗ．，ＬｏｗｅｒｉｎｇｔｈｅＵＶａｂｓｏｒｂａｎｃｅｓｉｎｇｌｅｌｉｎｅａｒｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅａｒｒａｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙＣｈｅｍ．１９９８，［５】ＣｕｌｂｅｒｔｓｏｎＣ．Ｔ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎｚｏｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｕｓｉｎｇａｄｅｔｅｃｔｏｒ［Ｊ］，ＡｎａＬ７０：２６２９．２６３８［６】ＭａｒｔｉｎＲ．Ｓ．，ＧａｗｒｏｎＡ．Ｊ．，ＬｕｎｔｅＳ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｕａｌ－ＥｌｅｃｔｒｏｄｅｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒＰｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）一ｆａｂｒｉｃａｔｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．２０００，７２：３１９６—３２０２ＶａｎｄａｖｅｅｒＷ．１Ｌ，ＰａｓａｓＳ．Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｆｏｒｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙ１ＬＳ．，ｅｔａｌ，Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎａｎａｐｅｒｏｍｅｌｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３：３６６７—３６７７ｏｆｃａｔｅｃｈｏｌｓｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｚｏｎｅ［８】ＷａｌｌｉｎｇｆｏｒｄＲ．Ａ．，ＥｗｉｎｇＡ．Ｇ，Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｍｎｏｒｍａｌａｎｄｍｉｃｅｌｌａｒｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］，Ａｎａ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，６０：２５８－２６３ａｎｏｎ—ｃｏｌｕｍｎｆｒｉｔｉｎｃａｐｉｌｌａｒｙｚｏｎｅ【９】ＨｕａｎｇＸ．，ＺａｒｅＮ．，Ｕｓｅｏｆｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ｓａｍｐｌｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ａｎａｌ［１０】Ｃｈｅｍ．，１９９０，６２：４４３＿４４６ＹｉｋＹＦ．，ＬｅｅＨ．Ｋ，ＬｉＳ．Ｅ，ｅｔ．ａ１．，Ｍｉｃｅｌｌａｒｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｃａｐｉｌｌａｒｙｃ１１ｒｏｍａｔｏ卿ｈｙｏｆｖｉｔａｍｉｎＢ－６ｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＺＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９１，５８５：１３９—１４４［１１］ＴｏｋｅｌＮ．Ｅ．，ＢａｒｄＡ．Ｊ．，ＥｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩＸ：ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＡｍ．ｅｍｉｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒｉｓ（２，２’－ｂｉｐｙｆｉｄｉｎｅ）ｒａｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ｊ］，ＺＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７２，９４：２８６２—２８６３［１２】ＮｏｆｆｓｉｎｇｅｒＪ．Ｂ．，ＤａｎｉｅｌｓｏｎＮ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｕｐｏｎｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｌｉｐｈａｔｉｃａｍｉｎｅｓｗｉｔｈｔｒｉｓ（２，２，－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（１ｉＤ川，ＡｎａｌＣｈｅｍ．，１９８７，５９：８６５—８６８［１３】ＭｃＣｏｒｄＰ．，ＢａｒｄＡ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）４，４＇－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅａｎｄｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）４，７一ｄｉｐｈｅｎｙｌ－１，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅｓｙｓｔｅｍｓｉｎａｑｕｅｏｕｓａｎｄａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＺＥｌｅｃｔｒｏａｎａＬＣｈｅｍ．，１９９１，３１８：９１－９９［１４】ＣｈｅｎＹＴ．，ＺｈｅｎＹＬ．，ＣｈｅｌａＪ．Ｈ．，ＳｕｎＪ．Ｊ．，ＺｈａｎｇＬ．，ＣｈｅｎＧＮ．，Ｎｅｗｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｒｎｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｅｑｕｉｐｐｅｄｗｉｔｈａｎｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ７６青岛科技大学研究生学位论文ｈｅａｔｅｄＲｕ（ｂｐｙ）３２＋／ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｐａｓｔｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ［Ｊ］，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，２００７，１１７２：８４－９１［１５１ＷａｎｇＺ．Ｐ．，ＬｉＪ．，ＬｉｕＢ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｄＴｅｎａｎｏｅｒｙｓｍｌｓｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｔｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｔａｌａｎｔａ．，２００９，７７：１０５０—１０５６［１６】ＫｎｉｇｈｔＡ．Ｗ，ＧｒｅｅｎｗａｙＧＭ．，Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｏｎ－ａｎｎｉｈｉｌａｔｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｒｏｍａｔｉｃｔｅｒｔｉａｒｙ．ａｍｉｎｅｓ［Ｊ］，Ａｎａｌｙｓｔ，１９９５，１２０：２５４３－２５４７［１７】ＬｅｅＷＹ’Ｔｒｉｓ（２，２，－ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（１０ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｎａｎａｌｙｔｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］，Ｍｉｋｒｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，１２７：１９－３９［１８］ＥｇａｓｈｉｒａＮ．，ＫｕｍａｓａｋｏＨ．，ＫｕｒａｕｃｈｉＹ．，ｅｔ．ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓｂｙｃｙｃｌｉｃｓｑｕａｒｅ－ｗａｖｅｅｌｅｃｔｒｏｌｙｓｉｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏａｌｌａｌｃｏｈｏｌｓｅｎｓｏｒ［Ｊ］，ＡｎａｌＳｃｉ．，２００４，１０：４０５－４０８［１９】ＭａｒｔｉｎＡ．Ｆ．，ＮｉｅｍａｎＴ．Ａ．，Ｇｌｕｃｏｓｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｕｓｉｎｇ缸ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｇｌｕｃｏｓｅ－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｅｎｚｙｌｎｅｒｅａｃｔｏｒａｎｄａｔｒｉｓ（２，２＇－ｂｉｐｙｄｄｙｌ）ｒｕｔｈｅｍｕｍ０Ｉ）ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｓｅｎｓｏｒ［Ｊ］，ＡｎａｌＣ厅砌．Ａｃｔａ，２００３，２８１：４７５－４８１【２０】ＯＣｏｎｎｅｌｌＣ．Ｄ．，ＪｕｈａｓｚＡ．，ＫｕｏＣ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｉｎｒｎａｉｎｍｅｌａｎｏｍａｂｙｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｃｒａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，４４：１１６１．１１６９［２ｌ】ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎＨ．Ｐ．，ＡｎｄｅｒｓｏｎＰ－，ＷａｎｇＸ．，ｅｔ．ａｌ，ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｍａｌｌｐｅｐｔｉｄｅｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄＲｕ（ｂｐｙ）３２＋－ｂａｓｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ．，，２０００，６５：１８９—１９５【２２］ＷａｎｇＸ．，ＢｏｂｂｉｔｔＤ．Ｒ．，ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｇｅｎｅｒａｔｅｄＲｕ（ｂｐｙ）３３＋－ｂａｓｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅｌｌａｒｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］，Ｔａｌａｎｔａ，２０００，５３：３３７．３４５［２３】ＡｒｏｒａＡ．，ＥｉｊｋｅｌＪ．Ｃ。Ｔ．，ＭｏｒｆＷ．Ｅ．，ＭａｎｚＡ．，Ａｗｉｒｅｌｅｓｓｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｉｒｅｃｔａｎｄｉｎｄｉｒｅｃｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｎａｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄｇｌａｓｓｄｅｖｉｃｅ［Ｊ］，ＡｎａｌＣｈｅｍ．２００１，７３：３２８２．３２８８［２４】ＷａｎｇＷ．，ＸｉｎＨ．，ＳｈａｏＨ．Ｌ．，ｅｔ．ａｌ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｉｎｓｉｎｇｌｅｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ，２００３，７８９：４２５－４２９［２５】ＴｏｋｅｌＮ．Ｅ，ＢａｒｄＡ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｅｍｉｓｓｉｏｎｆｒｏｍｓｙｓｔｅｍｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｒｉｓ（２，２’一ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ｊ］，ＺＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７２，９４：２８６２．２８６３７７微流控芯片单细胞分析结论本论文首先采用毛细管电泳柱前ＮＤＡ衍生电化学检测的方法实现了牛磺酸的定量检测，并对人血液样品中牛磺酸的含量进行了检测。其次，以ＰＤＭＳ／玻璃做为芯片制作材料，设计研制了可方便更换电极的集成芯片毛细管电泳电化学检测器，并以该系统为平台，采用柱端安培检测的方式，以碳纤维簇微盘电极为工作电极，检测了大鼠腹腔肥大细胞溶膜液中抗坏血酸的含量。并在此基础上，又采用自制的碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰的碳纤维微盘电极为工作电极，分别检测了大鼠腹腔肥大细胞溶膜液和单个大鼠腹腔肥大细胞中抗坏血酸的含量。实验中还设计了一种集成化微芯片毛细管电泳电化学发光检测系统，并以ＰＤＭＳ／玻璃作为芯片材料，碳纤维簇微盘电极为工作电极，Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋作为发光试剂，首次将Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋电化学发光与微流控芯片联用技术用于谷胱甘肽的分析，并初步研究了该方法的可行性。本论文的重点是采用自制的碳纳米管／纳米普鲁士蓝修饰的碳纤维工作电极，以自行设计制作的微流控芯片电化学检测系统为平台检测抗坏血酸，降低了抗坏血酸的检测限，并在芯片上完成了单个大鼠腹腔肥大细胞的进样、溶膜以及单个细胞中抗坏血酸含量的测定。７８微流控芯片单细胞分析致谢本论文是在孙雪梅副教授的悉心指导下完成的。在我三年的实验中所取得的每一点进步无不包含了孙老师辛勤的指导，孙老师严谨的治学态度、锐意的创新精神和高尚的科学精神，将使我获益终生。谨此向孙老师致以衷心的感谢！本论文在选题和进展过程中还得到了张书圣教授的大量指导，张老师渊博的学识、敏锐的科学洞察力和严谨的治学态度使我受益匪浅。感谢本实验室的李雪梅老师、梅振华老师、张召香老师、于凤丽老师，牛燕、鲍军方、毕赛、刘涛、张国凡等同学对我无私的帮助和支持。特别要感谢我的丈夫孙洪广和孩子孙祺皓，他们对我生活上的关心，以及精神上的鼓励，使我能够安心完成我的学业。同时也要感谢我的父母，他们的养育和关怀是我一直能够前进的动力，虽然他们年龄大了，但是他们的精神鼓励永远都是我克服困难的精神动力。最后，感谢以上未提及的曾经帮助过我的师长、同学和好友。感谢国家自然科学基金和青岛科技大学博士后启动基金对本课题的资助。何鹏２００９年４月１５日青岛科技大学研究生学位论文攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录【ｌ】ＰｅｎｇＨｅ，ＹａｈＮｉｕ，ＺｈｅｎｈｕａＭｅｉ，ＪｕｎｆａｎｇＢａｏ，ＸｕｅｍｅｉＳｕｎＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（ＩＦ＝－２．９３５）【２】ＸｕｅｍｅｉＳｕｎ，ＰｅｎｇＨｅ，ＧｕｏｆａｎＺｈａｎｇ，ＳｈｕｓｈｅｎｇＺｈａｎｇＩｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌａｎａｌｙｓｉｓＡｎａｌｔｈｅｍ．，ｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ【３】ＸｕｅｍｅｉＳｕｎ，ＰｅｎｇＨｅ，ＳｈｕｓｈｅｎｇＺｈａｎｇｒａｔＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｌｙｓｉｓｂｙｍｉｃｒｏｃｈｉｐｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎＪ．Ｃｈｔｏｍ．及．ｉｎ【４】ＸｕｅｍｅｉｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎＳｕｎ，ＰｅｎｇＨｅ，ＧｕｏｆａｎＺｈａｎｇ，ＳｈｕｓｈｅｎｇＺｈａｎｇｒａｔｐｅｒｉｔｏｎｅａｌＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｉｎｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍａｓｔｃｅｌｌｓｂａｓｅｄｏｎｏｒｇａｎｉｃｐｏｌｙｍｅｒｐｒｏｔｅｃｔｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｉｔｈｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄｃａｒｂｏｎｎａｎｏｔｕｂｅｓｍｏｄｉｆｉｅｄｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓｂｙｍｉｃｒｏｃｈｉｐ－ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎＥｉｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［５］何鹏，孙久龙，孙雪梅柱前ＤＮＡ衍生毛细管电泳电化学检测人血液中的牛磺酸青岛农业大学学报（自然科学版），２００８，２５（４４）：３１１—３１４［６】孙雪梅，何鹏，牛燕，张书圣毛细管电泳电化学检测单个腹腔肥大细胞中的抗坏血酸第二届国际微流控会议暨第五届全国微全分析系统学术会议，南京，中国，２００８，ｐ２６３［７】孙雪梅，牛燕，何鹏，刘涛，张书圣毛细管电泳电化学发光检测单个大鼠肝细胞中的抗坏血酸第二届全国生命分析化学学术报告与研讨会论文集，北京，中国，０３，２８．３１，２００８，Ｐ２６２［８】鲍军方，何鹏，于锡娟，姜世丽，颜清云纳米金探针检测Ｈ９２＋离子化学学报，接受（ｉｖ＝－０．８４４）８１微流控芯片单细胞分析

作者：学位授予单位：

何鹏青岛科技大学

1.期刊论文 夏方铨.金文睿.殷学锋.方肇伦.XIA Fang-Quan.JIN Wen-rui.YIN Xue-feng.FANG Zhao-Lun 微流控芯片电化学检测单细胞分析 -高等学校化学学报2004,25(z1)

微流控芯片已被用于进行各种细胞分析的研究.最近,方肇伦等[1]用十字型微流控芯片压力进样,激光诱导荧光检测进行了人单个血红细胞内谷胱甘肽的测定.用双T型微流控芯片电化学检测方法对小麦愈伤组织中抗坏血酸(AA)的单细胞分析进行了研究.

2.会议论文 程介克.王宗礼 微流控芯片用于单细胞分析展望 2007

单细胞分析是分析化学、生物学和医学之间渗透发展形成的跨学科前沿领域。细胞是生命活动的基本单位，为了掌握生命过程的规律，必须以研究细胞为基础，深入探索细胞的行为。本文研究毛细管电泳用于单细胞分析。

3.学位论文 孙悦 微流控芯片上单细胞分析的研究 2006

检测单个细胞内化学组分，以及测定单细胞对外界刺激的成分变化，有助于理解基本细胞功能以及细胞内外联系，有助于检测和鉴别大量细胞群体中少量的不正常细胞，因此单细胞的研究在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、病理过程的研究方面有重要意义，已成为目前生命科学、生化分析等学科研究的热门课题之一。

由于单细胞体积小，胞内物质浓度低，需要高灵敏度的检测方法，如激光诱导荧光(LIF)法。但是大多数胞内组分浓度低又无天然荧光，因此在解决微衍生的问题上还存有相当的空间。

最近，用微流控芯片技术对生物细胞的研究引起了广泛注意，在近些年来得到快速发展。微流控芯片微米尺寸的通道适于单细胞引入，操纵，反应，分离及检测。

本论文首次用芯片毛细管电泳-激光诱导荧光法定量测定了单个人血红细胞内的活性氧(ROS)，将细胞进样、单细胞定位、溶膜和毛细管电泳分离，集成到一块玻璃微芯片完成。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)、过氧化氢等，它不但与衰老、动脉硬化、关节炎、细胞凋亡及癌变等密切相关，并且由于它易扩散和降解，普遍存在于各类细胞中，它还起细胞间信使分子的作用。因此，细胞内ROS的测定已受到普遍重视。我们用可透膜的双氢罗丹明123(DHR123)作为衍生试剂，DHR123无荧光，进入细胞后，以细胞本身作为微反应器，和细胞内ROS反应生成荧光产物罗丹明123(Rh123)，通过微芯片电泳激光诱导荧光法检测细胞内的Rh123，间接对细胞内ROS进行了定量。我们讨论了Rh123迁移时间随pH的变化，得到最佳检测条件，通过标准曲线法，定量测定了单个人血红细胞内ROS。该法由于避免了制备细胞悬液时溶剂的稀释作用，使分析灵敏度大大提高。方法检测下限为0.74amol，每分钟检测两个细胞，连续测定6个单细胞迁移时间的精密度为2.1％。为研究单细胞受外界刺激前后ROS的变化提供了方法和工具。

在微流控芯片单细胞分析中，细胞能够进入微通道是微流控芯片分析细胞的前提，但是，除了某些特定选择的可以避免吸附的细胞，大部分细胞倾向于吸附在细胞容器表面。人体肿瘤细胞在水溶液中贴壁、自聚集，以及因为重力引起的沉积成为芯片上单细胞操纵和分析的障碍。因此，本文用传统的光刻法和三步刻蚀法研制了新型多深度微流控芯片。其中进样通道深37μm，分离通道深12μm，在分离通道中距离十字交叉口300μm处加工一个1mm长的围堰，该处只有6μm深。通过加宽加深微流控芯片的进样通道，结合在生理盐水(PBS)中添加0.4％的羟丙基甲基纤维素(HPMC)配置细胞悬液，减少细胞在样品池中聚集和在进样通道中的贴壁，使肝癌细胞顺利地在进样通道流动。细胞流经十字口时，在电压作用下转入分离通道，被分离通道中设置的围堰截留，用含SDS的缓冲溶液迅速替换细胞周围原有的PBS-HPMC介质，然后使细胞在固定位置20s内静态溶膜。该围堰的设置缩短了细胞溶膜的时间，提高了电泳分离时迁移时间的精密度。我们以肝癌细胞中的谷胱甘肽(GSH)和ROS为研究对象，对此类芯片的应用进行了检验。此芯片可成功地用于检测肝癌细胞，每小时可测定15个。连续测定10个细胞，ROS迁移时间精密度为3.1％，GSH迁移时间精密度为4.9％。此类芯片制作简便，为单个肿瘤细胞以及其它易沉降易聚集易贴壁的细胞在微流控芯片上的分析提供了一个有效的平台。

要检测单细胞内组分，大多需先衍生。为了避免衍生时细胞内的痕量物质被衍生剂进一步稀释，柱前细胞内衍生法是最常见也是稀释效应最小的方法。然而，不是所有的衍生试剂都可进入细胞，如FITC。本文探索了用小脂质体包裹染料进入细胞的方法，用超声法制得大小均匀的平均直径为100纳米的小脂质体，探讨了脂质体过程中的影响因素及脂质体的稳定性。用荧光显微镜拍摄图片证明该脂质体可以介导不透膜荧光染料FITC、RhodamineB进入细胞。脂质体和细胞共培育，细胞内荧光随脂质体和细胞培育的时间延长而增强，在2h后基本达到平衡，实验证明脂质体转染细胞不影响细胞活性。用芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测FITC脂质体标记后的细胞，得到多个电泳峰。说明FITC在脂质体介导下进入细胞后可以标记细胞内的氨基酸和蛋白质。

超氧化物歧化酶(Superoxidediamutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内的金属蛋白，它能催化并清除细胞内的超氧阴离子(O2.-)，保护细胞免受自由基的氧化破坏，在解氧毒害、辐射损伤等方面具有重要作用。天然SOD由于其分子量较大，基本不能进入细胞内。超声法制备包裹SOD的纳米脂质体，用芯片毛细管电泳测定SOD脂质体投递前后细胞内的ROS和GSH，发现肿瘤细胞和SOD脂质体作用后，ROS含量下降，GSH含量升高，该实验结果与流式细胞仪所得结果相吻合，说明超声法制得的SOD脂质体仍保持有良好的活性，可有效清除细胞内活性氧。

4.期刊论文 程介克.Cheng Jie-ke 微流控芯片用于单细胞分析 -高等学校化学学报2004,25(z1)

微流控芯片通道内径一般约10～50μm.典型哺乳类动物细胞直径一般为8～30μm,体积为87fL～4 pL.微流控芯片的微结构与细胞的尺寸相匹配,成为单细胞很有发展前景的分析技术.

5.期刊论文 程介克.黄卫华.王宗礼.CHENG Jieke.HUANG Weihua.WANG Zongli 单细胞分析的研究 -色谱2007,25(1)

单细胞分析是分析化学、生物学和医学之间渗透发展形成的跨学科前沿领域.近年来,毛细管电泳及微流控芯片用于单细胞分析已取得显著进展,特别表现在微流控芯片用于细胞的培养、分选、操纵、定位、分离及检测细胞的组分,实时监测细胞释放,及高通量阵列检测等方面.芯片的单元操作可根据需要灵活组合,显示出其独特的优点.本文重点介绍作者研究组的工作,并对近三年来国内外在毛细管电泳及芯片毛细管电泳用于单细胞分析的新进展进行评论.最后从毛细管电泳与微流控芯片、微流控芯片与细胞界面以及量子点用于探测活细胞等方面,展望了单细胞分析的发展前景.

6.学位论文 王文雷 微流控电泳芯片在单细胞分析中的应用 2004

微流控分析系统(μTAS)在生物细胞领域的发展引起了广泛的关注.微流控芯片的微米尺寸的通道更适合单细胞样品的引入,操纵,反应,分离和检测.因此将这些功能集成在微流控芯片上成为当前分析的一个热点.本论文用微流控电泳芯片对单细胞分析进行一些研究.主要分三部分:Ⅰ.微流控电泳芯片电化学检测人单个肝癌细胞中的谷胱甘肽.Ⅱ.人单个活细胞中过氧化物酶的测定.Ⅲ. Br<'->和CN<'->对活细胞内酶活性的影响.第一部分用微流控电泳芯片电化学检测的方法测定了人单个肝癌细胞中的谷胱甘肽.我们选择用电泳缓冲液代替常用的PBS作为细胞悬浮液,用压力将单个细胞导入芯片的双T交叉点,用毛地黄皂苷化学蚀孔和外加电场相结合的溶膜方式,利用金汞齐电极对谷胱甘肽良好的选择性检测得到单个细胞中谷胱甘肽唯一的电泳峰.实现了芯片毛细管电泳/电化学检测单细胞的快速分离优势及选择性检测.然后用标准曲线对细胞中谷胱甘肽的含量进行了定量,测得人单个肝癌细胞中谷胱甘肽含量与文献值一致.第二部分建立了一种微流控电泳芯片电化学检测人单个活细胞内髓过氧化物酶(MPO)的方法.我们先用毛地黄皂苷将细胞蚀孔,然后通过电迁移将蚀孔后的单个中性粒细胞导入芯片双T交叉点并贴壁.缓冲液中底物H<,2>Q和H<,2>O<,2>通过细胞膜上的微孔扩散进入细胞,被胞内MPO催化反应生成电活性产物BQ.BQ通过细胞膜上微孔扩散回到细胞周围的溶液中,在细胞周围形成BQ区带.再加电泳电压将此区带迁移到分离通道的检测端并用碳纤维微盘电极检测.得到的电泳峰的峰面积对应于活细胞内MPO的含量.通过同一个细胞溶膜后电泳峰面积及标准溶液电泳峰的峰面积可以对活细胞内MPO进行定量.测得人单个中性粒细胞内MPO含量与细胞提取液中测得值一致.第三部分研究了Br<'->和CN<'->对人单个活中性粒细胞内MPO活性的影响.Br<'->和

CN<'->对胞内MPO影响非常明显.2.5×10<'-2>mol/L Br<'->对中性粒细胞中MPO刺激40 min后其活性降为原来的32%.5×10<'-4> mol/L CN<'->对中性粒细胞中MPO活性的抑制作用更显著,40 min后其活性降为原来的7.8%.

7.会议论文 李向军.袁倬斌 单细胞分析研究进展 2007

作为最小的生命结构单元之一,细胞对于生物体功能的正常发挥起着重要作用,长久以来,研究工作者一直在寻找新的分析方法和技巧从事细胞簇、单细胞、亚细胞的研究。近年来,在样品获取、细胞操纵、细胞内容物的测量及细胞间动力学过程的方面都取得了很大进展,单细胞分析已经成为分析化学一个重要的研究内容,除了大量的研究报告之外,已经有了自己的专业会议论坛,如德国Münste的单细胞测量会议。本文介绍了细胞的选择与分离，简述了单细胞分析方法，包括血细胞计数法、微流控芯片法、毛细管电泳法电化学检测、质谱法、激光诱导荧光检测等。

8.学位论文 曲绍风 落射荧光显微术高通量分析单细胞中的酯酶 2006

本论文用落射荧光显微术对单细胞分析进行了一些研究。共分三章：第一章落射荧光显微术检测胃癌细胞中的酯酶。第二章．落射荧光显微术高通量检测单个胃癌细胞中的酯酶。第三章．高通量微流控芯片分析单个胃癌细胞中的酯酶。

第一章我们采用落射荧光显微术对胃癌细胞提取液中酯酶的活性进行了鉴定。在这部分实验中是以FDA作为底物，FDA这种物质可以通过细胞膜自由地渗透到细胞里面去，在细胞内酯酶的催化作用下发生反应产生一种新的物质，这种物质在激光的激发下会产生荧光，我们通过分析这种生成物质的荧光强度来实现对酯酶的测定。我们首先对实验的最佳条件进行研究，包括采用底物FDA的浓度、缓冲溶液的pH、FDA在酯酶作用下反应的时间与生成物质荧光强度之间的关系等。最终通过标准曲线法进行定量。

第二章我们用落射荧光显微术高通量检测单个胃癌细胞中的酯酶，研究了一种高通量检测细胞的方法。我们将细胞在灭菌之后的反应池中贴壁以后，加入FDA溶液进行孵育。FDA会自由地渗透到细胞里面去，在细胞内酯酶的作用下产生一种物质。我们通过分析这种物质的荧光强度来检测细胞内的酯酶。在这部分实验中我们对底物的浓度、反应时间等进行了研究。根据标准曲线法对单个细胞中的酯酶活性进行了高通量测定。

第三章我们用微流控芯片通过落射荧光显微镜对细胞中的酯酶进行了高通量分析。在这部分实验中，我们自己制作了微流控芯片，芯片通道采用PDMS膜制成，然后将膜封接到盖玻片上。以FDA作为细胞中酯酶的底物，我们利用这种简易微流控芯片对由酯酶引起反应产生荧光信号的细胞进行了高通量分析。

9.期刊论文 李涛.唐宏武.周锦松.陈观铨 微流控进样阿达玛变换显微荧光成像单细胞分析 -分析化学2004,32(5)

将微流控芯片用于单细胞进样,以自制阿达玛变换显微荧光成像分析系统进行成像检测,讨论了影响单细胞进样和荧光成像的主要因素,并对花粉细胞DNA含量进行定量分析.结果表明:微流控进样技术与HT显微成像技术相结合,可有效可靠地应用于单细胞分析中,所测定的三个玉帘花粉的DNA含量分别为124.4、123.9和62.9 pg.

10.会议论文 黄勇.石明.赵书林 单个大鼠肝细胞的微流控芯片化学发光分析 2009

由于细胞内化学组分及生物活性的高度非均匀性，单细胞分析特别是对细胞内组分的定性定量分析，对于分子生物学，生物过程的物理化学模型及疾病的早期诊断与治疗等具有重要意义，是分析化学领域的热点研究课题之一。由于细胞的直径一般为微米级，体积极小，细胞内组分含量非常低(fmol—zmol)且极为复杂，因此检测细胞内的超痕量组分,具有较大的难度。本文基于抗坏血酸和氨基酸对luminol-K3Fe(CN)6化学发光体系的强烈增敏作用，采用自组装的微流控装置结合化学发光检测技术，建立了单个大鼠肝细胞中抗坏血酸和氨基酸的同时测定方法。

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下载时间：2011年1月26日