培养基平皿添加青霉素酶验证预试验
1培养基平皿名称及代号： 平皿名称 NA平板 NA+P平板 TSA平板 TSA+P平板 NA接触碟 NA+P接触碟 TSA接触碟 TSA+P接触碟
2.培养基平皿层流采样
因目前本公司产品其抑菌性最强的是盐酸头孢吡肟/L-精氨酸原料药及其制剂，所以本次验证将选择风量大粉尘大的地点进行采样，且采样时须进行盐酸头孢吡肟/L-精氨酸原料药或其制剂生产操作。 2.1沉降菌检测采样
按《洁净区微生物监测标准操作规程》SOP-QA-031-V00进行操作。打开培养皿（规格型号：90mm）盖，使培养基表面在百级层流下暴露4小时（风淋4小时），再将培养皿盖盖上后交QC处理。
采样地点：107车间（由QA定具体位置） 采样高度：0.8~1.5m。（日常采样高度或平台上） 每种培养基采样数量： 20皿/采样地点（百级层流） 2.2附着菌检测采样
按《洁净区微生物监测标准操作规程》SOP-QA-031-V00进行操作。采样完后再将培养皿交QC处理。
采样地点：201车间（由QA定具体位置）
每种培养基采样数量： 20皿/采样地点（百级层流）
规格型号 90mm 90mm 90mm 90mm 65mm 65mm 65mm 65mm 批号 G90NA120712-4 G90NA+P120712-5 G90TSA120626-1 G90TSA+P120712-3 G65NA120712-4 G65NA+P120712-5 G65TSA120705-1 G65TSA+P120712-3 代号 NA-1 NA-2 TSA-1 TSA-2 NA-3 NA-4 TSA-3 TSA-4
3 促生长试验： 3.1菌种
（1）细菌：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104] 大肠埃希菌[CMCC（B）44102]
（2）细菌芽孢：枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501] 3.2菌液制备：
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基上，经30～35℃培养18～24小时，取上述培养物分别加入0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔转移至空试管中作为菌悬液原液，用0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍梯度稀释至浓度（500～1000）cfu/ml。 3.3试验组：
采用涂布法进行接种，将含菌量（500～1000）cfu/ml的金黄色葡萄球菌、
大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液分别接种0.1ml至经采样后的培养基上，然后用无菌涂布棒快速地将其均匀涂布，每种菌悬液各接种2皿，于30~35℃培养72小时，测定菌数。 3.4阳性对照组：(未经采样的各种培养基平板)
采用涂布法进行接种，将含菌量（500～1000）cfu/ml的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液分别接种0.1ml至未经采样的各种培养基中，每种试验菌在每种培养基中平行制备2个平板，于规定温度下培养72小时，测定菌数。
3.5菌液组：（菌液组所用的培养基须使用新鲜制备培养基）
采用涂布法进行接种，将含菌量（500～1000）cfu/ml的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液分别接种0.1ml至NA培养基和TSA培养基中，每种试验菌在每种培养基中平行制备2个平板，于30~35℃温度下培养72小时，测定菌数。
3.6供试品对照组：取经采样后的每种培养基平皿（未加菌处理的），于30~35℃培养120小时，按菌落计数法测定供试品本底菌数。 4.可接受标准：
4.1阳性对照组的菌回收率均应在70%~130%之间，则促生长试验结果有效，否
则判批培养基平皿适用性检查不符合规定。
注：阳性对照组回收率（%）=阳性对照组平均菌落数÷菌液组平均菌落数×100 4.2试验组的菌回收率均应在70%~130%之间，则促生长试验结果有效，否则需重新进行试验。
注：试验组回收率（%）=（试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数）÷
阳性对照组平均菌落数×100
5.培养基平板营养性再确认
5.1将经培养120h后的供试品对照组平皿，按“促生长试验”中的“3.1~3.3、3.5、3.6”进行加菌试验操作。
试验组：采用涂布法进行接种，将含菌量（500～1000）cfu/ml的金黄色葡萄球
菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液分别接种0.1ml至经采样培养120小时后的培养基上，然后用无菌涂布棒快速地将其均匀涂布，每种菌悬液各接种2皿，于30~35℃培养72小时，测定菌数。 菌液组：（菌液组所用的培养基须使用新鲜制备培养基）
采用涂布法进行接种，将含菌量（500～1000）cfu/ml的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌菌悬液分别接种0.1ml至NA培养基和TSA培养基中，每种试验菌在每种培养基中平行制备2个平板，于30~35℃温度下培养72小时，测定菌数。
供试品对照组：测定供试品本底菌数。
5.2试验组的菌回收率均应在70%~130%之间，则促生长试验结果有效，否则需重新进行试验。
注：试验组回收率（%）=（试验组平均菌落数—供试品对照组平均菌落数）÷
菌液组平均菌落数×100
