抑制素α亚基在大鼠体内的免疫组化定位

抑制素α亚基在大鼠体内的免疫组化定位

张中霞，李莲，徐璐， 闫玉琴，王根林

南京农业大学动物科技学院 (210095)

E-mail ( genlinwang@hotmail.com)

摘要：用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶 (Strept Avidin-Biotin-Peroxidase Complex， SABC)免疫组织化学方法，以抑制素α亚基单克隆抗体对正常雌性性成熟大鼠各组织的抑制素α亚基进行定位观察，结果显示：⑴大鼠心脏、肾、脾、淋巴、肾上腺、胰腺均呈阳性反应，表明存在抑制素α亚基；下丘脑、垂体、肝脏和肺组织呈阴性反应，表明其不存在抑制素α亚基；⑵与去卵巢大鼠相比,外源注射抑制素α（1～32）片段的大鼠其下丘脑和垂体出现阳性反应，说明抑制素α亚基能通过血脑屏障。 关键词：抑制素,抑制素α片段,免疫组化定位

1．引言

抑制素（inhibin，INH）由α和β两个亚单位组成的二聚体，相对分子质量是32 000，它是TGFp家族成员，具有具有选择性抑制垂体FSH的产生和分泌、以及旁分泌和自分泌作用。单个α亚基虽然没有抑制素生物活性，但可抑制FSH与其受体结合[1]。INHα通常被认为存在于睾丸的Sertoli细胞和卵巢的粒层细胞中。有研究者发现其尚可表达于性腺外组织，如人类、兔和大鼠的胎盘（Noguchi ，1997）[2]，人类精液及动物的胃液，垂体、骨髓和中枢神经系统（Meunier et al.1988）[3]。目前的研究说明，虽然性腺是INH来源的主要部位，但INH还很可能存在较为广泛的性腺外来源，鉴此，本研究通过免疫组化法进行INHα在大鼠体内各器官组织中的定位，进一步阐明INH的分泌来源，并为探讨其通过旁分泌或自分泌影响靶器官各种生理功能的机制，以及开展相关疾病的基础和临床研究提供可靠依据。

2．材料与方法

2.1试验动物

正常雌性性成熟SD大白鼠30只，购自南京青龙山实验动物场。

2.2试剂与材料

抑制素α亚基（1～32）片段（sigma公司，批号：I81），抑制素α亚基单克隆抗体（sigma公司，批号：I2777）；SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号SA102100），包括正常山羊血清封闭液、生物素化羊抗小鼠IgG 、SABC（Strept Avidin-Biotin-Peroxidase Complex ，链酶亲和素—过氧化物酶复合物）、复合消化液、 1

本课题得到教育部博士基金（项目编号：20010307007）资助

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抗原修复液；3,3’-二甲基联苯胺（3,3’-diamino-benzidine ，DAB）、显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号 AR1022）、粘片剂多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine) (武汉博士德生物工程有限公司，批号AR0001 )、中性树胶（上海标本模型厂产品）

2.3方法

2.3.1动物处理

正常性成熟雌性SD大鼠30只，在20～22℃室内饲养，自由饮水与采食。处理如下：20只大鼠去卵巢，10只大鼠假摘，饲养1周后，分为3组，第一组为对照组（未去卵巢），第二组（10只）去卵巢后分别腹腔注射INHα片段2μg,1μg, 0.5μg，第三组（10只）去卵巢后注射生理盐水（作为第二组的阴性对照），两组在注射后6h与对照组大鼠一起处死，取其下丘脑、垂体、心脏、肾、脾、颈部淋巴结、肾上腺、胰腺、肝脏及肺。此外，在各组内分别设阴性对照即在免疫组化染色过程中以正常小鼠血清替代一抗。 2.3.2石蜡切片的制作

将取出的组织立即固定于10%中性甲醛中、脱水、透明、透蜡、包埋、切片（组织片厚4μm）、用多聚赖氨酸事先处理好的玻片进行贴片后放入37℃恒温箱烘干过夜，4℃保存备用。 2.3.3免疫组织化学定位

抑制素的免疫组织化学其原理是组织中的蛋白（抗原）与一抗结合后，再与生物素化二抗、辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的链霉亲和素共同孵育，DAB显色后，组织中的抗原抗体复合物呈棕色沉淀（即为阳性）。切片常规脱蜡水化后，滴加3％H2O2，室温10min以灭活内源性酶。双蒸水洗3次，再用 92～98℃0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原热修复20min，冷却后用PBS（phosphare buffered saline ，0.01M，PH7.4）洗涤1～2次；滴加正常山羊血清封闭液孵育20min以减少非特异性染色；滴加一抗（抑制素α亚基单克隆抗体，25μg/ml），阴性对照组以正常小鼠血清替代一抗，37℃孵育1hr，滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG），37℃ 孵育20min，以上两步处理后均用PBS（0.01M，PH7.4）洗2min×3次；滴加SABC，37℃ 孵育20min，PBS洗5min×4次；滴加DAB显色，约10min后就可见棕色背景。蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染1min后脱水、透明、封片。将做好的切片放入37℃温箱烘干后进行光镜下观察。按照试剂盒说明，以免疫组化反应棕黄色为阳性反应，阴性对照为正常小鼠血清替代一抗的反应体系。

3．结果

利用抑制素α亚基抗体对正常性成熟雌性大鼠体内抑制素α亚基分布的免疫组化结果见表1，其阳性观察标准参照文献[4], 即细胞呈棕黄色为阳性（+），无棕色细胞则为阴性（-）。染色结果：对照组大鼠下丘脑、垂体、心脏、肾、脾、颈部淋巴结、肾上腺、胰腺、肝脏及肺均呈阳性；去卵巢后大鼠下丘脑、垂体、肝脏和肺呈阴性，其他各组织仍呈阳性。外源注射INHα片段后，以上各组织均呈阳性。后附部分免疫组化切片图。

表1抑制素α亚基在大鼠体内各组织免疫组化测定结果

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Table1 Immunoreactivity for inhibin-αsubunit in mature rats

注射INHα片段浓度/μg/ml

标本 Specimen

下丘脑Hypothalamus 垂体Pituitary 淋巴结Lympth node 肾上腺Adrenal 心Heart 肝Liver 脾Spleen 肺Lung 肾Kidney 胰Pancreas

对照组 Control

+ + + + + + + + + +

去卵巢组 Ovariectomized

- - + + + - + - + +

The intense of injected

INH-αfragment 2 1 0.5 + + - + + - + + + + + + + + + + - - + + + + - - + + + + + +

注：免疫反应结果（result of immunoreactivity）： -（Negative）；+（Positive）。

图2抑制素α亚基在去卵巢大鼠垂体的免疫图1抑制素α亚基在正常大鼠垂体的免疫染色，反应呈阳性（如箭头所示）。(×80 DAB染色)

Fig.1 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the Pituitary of the mature rat. It showed posititve reactivity.(arrow)(×80 DAB stain)

Fig.2Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the Pituitary of the ovariectomized rat. It showed negative reactivity.(×80 DAB stain)

染色，反应呈阴性。(×80 DAB染色)

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图4 抑制素α亚基在去卵巢大鼠肝脏的免图3 抑制素α亚基在正常大鼠下丘脑的免疫染色，反应呈阳性（如箭头所示）(×80 DAB染色)

Fig.3 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the hypothalamus of the mature rat. It showed posititve reactivity.(arrow)(×80 DAB stain).

Fig.4 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the liver of the ovariectomized rat. It showed negative reactivity.(×40 DAB stain)

疫染色，反应呈阴性（×40 DAB染色）

图5抑制素α亚基在去卵巢大鼠肾脏的免疫染色，反应呈阳性（如箭头所示）(×40 DAB染色)

图6抑制素α亚基在去卵巢大鼠胰腺的免疫染色，反应呈阳性（如箭头所示）(×40 DAB染色)

Fig.5 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the kidney of the ovariectomized rat. It showed posititve reactivity.(arrow)(×40 DAB stain)

Fig.6 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the pancreas of the ovariectomized rat. It showed posititve reactivity.(arrow) (×40 DAB stain)

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图8 抑制素α亚基在去卵巢大鼠肺的免疫图7 抑制素α亚基在正常大鼠肺的免疫染色，反应呈阳性（如箭头所示）(×80 DAB染色)

Fig.7 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the lung of the mature rat. It showed posititve reactivity.(arrow)(×40 DAB stain).

Fig.8 Mutural rat immunostained for inhibinαsubunit in the lung of the ovariectomized rat. It showed negative reactivity.(×40 DAB stain).

染色，反应呈阴性（×40 DAB染色）

4．分析与讨论

本实验用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（Strept Avidin-Biotin-Peroxidase Complex SABC）免疫组织化学方法，对大鼠体内各组织中INHα进行定位，结果显示：大鼠心脏、肾、脾、垂体及肾上腺均不同程度地存在INHα亚基，下丘脑、垂体、肝脏及肺则不存在INHα。这与Meunier et al（1988）以及Mckeehan et al.

[3]

[5]

的研究报道相一致。

但所不同的是我们还证实了大鼠心脏、颈部淋巴组织、胰腺也有INHα分布。然而，Peeters

et al (1997)[6]试验证实绵羊的肺中含有INHα，亦有资料表明灵长类黄体组织有INHα和

β亚基的表达，而其它种属动物没有。这提示INHα的分布及表达存在种属差异。

同时，本试验还证实大鼠心脏、肾、脾及肾上腺能分泌INHα，说明存在INHα的性腺

et 外来源，从而提示抑制素可能对心脏、肾、脾及肾上腺具有局部调节作用。如Yamaguchi al. （1991）已证实羊和人的肾上腺皮质存在INHα，并可调节ACTH的表达[7]。现有研究表

明动物去卵巢后，其血液中几乎无活性INH，故推测心脏、肾、脾及肾上腺对循环血液中INH的浓度可能无影响。

通过对去卵巢大鼠注射不同剂量的INHα片断发现下丘脑及垂体等组织中阳性反应有不同程度的增强，说明外源注射的INHα片段能够通过血脑屏障到达体内组织，可能起旁分泌或自分泌作用。同时也说明脑内具有INHα亚基的结合位点，但此位点究竟是不是INHα亚基的特异性受体还不能得以确认，目前国内外有关INHα受体的研究报道还很少。

参考文献

[1]Robertson D M ,Cahir N , Findlay J K ,Burger H G, et al. The biological and immunological characterization of inhibin A and B forms in human follicular fluid and plasma[J]. J Clin Endorcrinol Metab, 1997,82(3):8-6

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http://www.paper.edu.cn [2] Noguchi J. Ontogeny of inhibin secretion in the rat testis: Secretion of inhibin-related proteins from fetal leydig cell and of bioactive inhibin from sertdi cells, Journal-of-Endecrinology, 1997,1（155）：27-34

[3] Helene Meunier , Catherine Rivier ,Ronald M, et al. Gonadal and extragonadal expression of inhibin α, βA and βB subunits in various tissues predict diverse function [J]. Proc Natl Soci USA ,1988, 85: 247-251.

[4] LMA Munro,A Kennedy, et al.The expression of inhibin/activin subunits in the humun adrenal cortex and its tumors. Journal of Endocrinology. 1999,161:341-347.

[5] Xu J, Mckeehan K, Matsuzaki K, et al. Inhibin antagonizes inhibition of liver cell growth by activin by a dominant negative mechanism .[J]biol Chem,1995;270:6380 一6313.

[6] Peeters R, Vanmontfort D, Van Isterdael J,R.,.Evidence for the presence of immunoreactive inhibin in extragonadal tissues of ovariectomized ewes.Anim Repro Sci.1997,48:257-268.

[7]Yamaguchi M, Mizunuma H, Miyamoto K,et al..Immunoreactive inhibin concentrations in adult men:presence of a circadian rhythm. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism.1991,72:554-559.

Immunohistochemical localization of inhibin-α subunit in

mature rats

ZHANG Zhong-xia , LI Lian , XU Lu, YAN Yu-qin, WANG Gen-lin

College of Animal Science and Technology,Nanjing Agricultural University , 210095

Abstract: Immunohistochemical localization of inhibin α-subunit in normal mature rats was carried out by using Strept Avidin-Biotin-Peroxidase Complex .The results showed that there was positive immunoreactivity of the McAb to inhibinα-subunit in heart ,kidney , spleen , lymph ,adrenal gland and pancreas cells. It indicated that inhibinα-subunit existed in the above tissues , But no positive sites were seen in hypothalamus, pituitary, lung and liver, that means they have no inhibinα-subunit. Compared with the ovariectomized rats, the hypothalamus and pituitary of the rats injected with inhibin-α fragment（1～32）showed an positive reaction, suggesting that inhibin α-subunit could pass through the blood-brain barrier .

Key words: Inhibin, Inhibin-α subunit , immunohistochemical localization 张中霞：女。1980年生。硕士研究生。主要从事抑制素研究。

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