【论文】紫外分光光度法测定富硒米中硒的研究

摘 要

硒是人体红细胞谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分,其主要作用是参与酶的合成,保护细胞膜的结构与功能免遭过度氧化和干扰。近年来研究表明,硒及硒化物(Sodium Selenete)除具有抗氧化作用外,还有抗肿瘤、延长寿命和提高机体免疫功能等作用。本实验,用邻苯二胺替代3,3-二氨基联苯胺,采用紫外分光光度法检测富硒米中的硒含量,以期为富硒食品提供简便的检测方法。在样品前处理过程中，由于硫酸本身含有硒，会影响测定。所以试用磷酸代替硫酸，进行酸化消解，实验结果令人满意。通过实验研究，在20℃～30℃温度下的最大测量波长为333nm。通过条件优化实验结果表明，邻苯二胺用量4.0ml，盐酸羟胺用量为2.0ml，EDTA用量为1.0ml，显色反应酸度pH值为4.0，显色反应时间为2h以上，为最佳实验条件。通过工作曲线的绘制，得到在6.0～60μg /L范围内线性回归方程:Y=0.01216X+0.00485 ，及线性相关系数R=0.9992 。回收率实验中,标准品的回收率在98.38%～106.3%之间,平均回收率达到102.1%,有较好的回收效果。精密度的测定实验结果表明，本法的RSD为0.7713%，具有较好的精密度。

关键词:紫外分光光度法，硒，邻苯二胺，富硒米

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Abstract

Selenium is the composition of human red blood cell glutathione peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase peroxide, its major role is to participate in the synthesis of enzymes and the Protection of cell membrane structure and function against over-oxidation and interference. Recent studies indicate that selenium and selenium compounds (Sodium Selenete) have the antioxidant effect, and also have anti-tumor, prolonging life and improving the role of immune function. In this study, alternativing o-phenylenediamine with 3,3-diaminobenzidine, using ultraviolet spectrophotometry to detect selenium in selenium-enriched rice, we can provide a simple detection method for the selenium-enriched food. In the preparation process of sample, the determination will be affected because sulfuric acid contains selenium. So after alternativing phosphoric acid with sulfuric acid and having the acid digestion, experimental results are satisfactory. Through experimental study, The largest measuring wavelength is 333nm at 20℃ ~ 30℃. After the adoption of Optimization, experimental results show the best experimental conditions as follows: o-phenylenediamine dosage of 4.0ml, hydroxylamine hydrochloride dosage of 2.0ml, EDTA dosage of 1.0ml, the color reaction acidity pH 4.0, the color reaction time of 2h or more. Curving drawn through the work, we get a linear regression equation in the 6.0~60μg/L: Y=0.01216X +0.00485, and its linear correlation coefficient R=0.9992. In the Recovery experiment, the standard recovery rate between 98.38% ~ 106.3%, and average recovery rate is 102.1%, All these demonstrate a good results. Experimental determination of precision show that the RSD of this method is 0.7713% with good precision.

Keywords:UV,Selenium, O-phenylenediamine,Se-rich rice

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目录

第一章 绪论..............................................................- 1 - 1.1选题背景..............................................................- 1 - 1.2研究意义..............................................................- 1 - 1.3文献综述..............................................................- 1 -

1.3.1 硒元素简介...........................................................- 1 - 1.3.2 生物样品中硒含量检测方法的研究进展....................................- 4 - 1.3.3 紫外-可见分光光度法..................................................- 7 - 1.3.4朗伯-比尔定律.........................................................- 9 -

1.4 研究的基本内容，拟解决的主要问题.................................- 10 - 1.5 研究步骤、方法......................................................- 10 - 第二章 实验内容........................................................- 11 - 2.1实验试剂.............................................................- 11 -

2.1.1 硒标准溶液..........................................................- 11 - 2.1.2 其他试剂............................................................- 11 -

2.2实验仪器.............................................................- 12 - 2.3实验方法.............................................................- 12 -

2.3.1测定最大吸收波长.....................................................- 12 - 2.3.2 条件实验............................................................- 12 - 2.3.3 正交试验............................................................- 14 - 2.3.4 标准曲线............................................................- 14 - 2.3.5 样品分析............................................................- 15 -

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第三章 结果与讨论......................................................- 17 - 3.1硒标准溶液条件优化实验的结果与讨论................................- 17 -

3.1.1测定最大吸收波长.....................................................- 17 - 3.1.2 条件实验............................................................- 18 - 3.1.3正交试验.............................................................- 23 - 3.1.4 标准曲线............................................................- 24 -

3.2样品分析.............................................................- 27 -

3.2.1未知样品的测定.......................................................- 27 - 3.2.2 回收率实验..........................................................- 27 -

3.3讨论..................................................................- 28 -

3.3.1邻苯二胺试液的浓度及反应时间.........................................- 28 - 3.3.2还原剂的时效.........................................................- 28 - 3.3.3 PH的影响............................................................- 28 - 3.3.4 实验的准确度........................................................- 28 - 3.3.5 前处理的注意事项....................................................- 28 - 3.3.6 萃取剂的挥发性......................................................- 29 -

第四章 结论与展望......................................................- 30 - 4.1 结论.................................................................- 30 - 4.2 对进一步研究的展望.................................................- 30 - 参考文献.................................................................- 31 - 致谢......................................................................- 33 - 声明......................................................................- 34 -

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第一章 绪论

1.1选题背景

硒是人体红细胞谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，其主要作用是参与酶的合成，保护细胞膜的结构与功能免遭过度氧化和干扰。近年来研究表明，硒及硒化物(Sodium Selenete)除具有抗氧化作用外，还有抗肿瘤、延长寿命和提高机体免疫功能等作用。机体缺硒将导致一系列疾病的发生，如克山病、大骨节病等。但世界上有40多个国家土壤中缺硒，我国有72%的地区属于缺硒地区，因此生产富硒食品成为我国功能性食品的研究热点之一。

1.2研究意义

目前，富硒米作为富集硒元素的载体，因其栽培面积广，操作简便，富集效果显著，在我国正被广泛应用。但对于硒含量的测定，常见的有分光光度法、荧光测定法和氢化物原子荧光光谱法。通常采用的分光光度法，所用的显色剂易氧化变质，水溶液也不稳定。而荧光光谱法对实验仪器要求较高。有文献介绍用邻苯二胺检测元素硒，因此，用邻苯二胺替代3，3-二氨基联苯胺，采用紫外分光光度法检测富硒米中的硒含量，以期为富硒食品提供简便的检测方法。

1.3文献综述

1.3.1 硒元素简介[1]

硒是稀散元素之一。在已知的六种固体同素异形体中，三种晶体（α单斜体、β单斜体，和灰色三角晶）是最重要的。也以三种非晶态固体形式存在；红色和黑色的两种无定形玻璃状的硒。前者性脆，密度4.26克/cm；后者密度4.28克/cm。第一电离能为9.752电子伏特。硒在空气中燃烧发出蓝色火焰，生成二氧化硒（SeO2）。也能直接与各种金属和非金属反应，包括氢和卤素。不能与非氧化性的酸作用，但它溶于浓硫酸、和强碱中。溶于水的硒化氢能使许多重金属离子沉淀成为微粒的硒化物[1]。

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硒的主要用途为：

1.光敏材料：如：干印术的光复制，这是利用无定形硒的薄漠对于光的敏感性，能使含有铁化合物的有色玻璃退色。也用作油漆、搪瓷、玻璃和墨水中的颜色、塑料。还用于制作光电池、整流器、光学仪器、光度计等。硒在电子工业中可用作光电管、太阳能电池，在电视和无线电传真等方面也使用硒。硒能使玻璃着色或脱色，高质量的信号用透镜玻璃中含2％硒，含硒的平板玻璃用作太阳能的热传输板和激光器窗口红外过滤器。

2.电解锰行业催化剂：冶金方面，电解锰行业的硒用量占到中国全部硒产量的较大比重，此外，含硒的碳素钢、不锈钢和铜合金具有良好的加工性能，可高速切削，加工的零件表面光洁；硒与其他元素组成的合金用以制造低压整流器、光电池、热电材料。硒以化合物形式用作有机合成氧化剂、催化剂，可在石油工业上应用。硒加入橡胶中可增强其耐磨性。硒与硒化合物加入润滑脂。

3. 动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素。由于硒是动物和人体中一些抗氧化酶（谷胱甘肽过氧化物酶）和硒-P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，研究证明具有提高动物免疫力作用，在国际上硒对于免疫力影响和癌症预防的研究是该领域的热点问题，因此，硒可作为动物饲料微量添加剂，也在植物肥料中添加微量元素肥，提高农副产品含硒量。硒已被作为人体必需的微量元素，目前，中国营养学会推荐的成人摄入量为每日50～250微克，而我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值，因此，中国是一个既有丰富硒资源，又存在大面积硒缺乏地区，这也是国际学者对中国感兴趣的原因 [2] 。

硒的作用：

硒的作用比较宽泛，如下文详述的多个方面，但其原理主要是两个：第一、组成体内抗氧化酶，能提到保护细胞膜免受氧化损伤，保持其通透性；第二、硒-P蛋白具有螯合重金属等毒物，降低毒物毒性作用。

硒被科学家称之为人体微量元素中的“防癌之王” （原称“抗癌之王”） 科学界研究发现，血硒水平的高低与癌的发生息息相关。大量的调查资料说明，一个地区食物和土壤中硒含量的高低与癌症的发病率有直接关系，例如：此地区的食物和土壤中的硒含量高，癌症的发病率和死亡率就低，反之，这个地区的癌症发

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病率和死亡率就高，事实说明硒与癌症的发生有着密切关系。同时科学界也认识到硒具有预防癌症作用，是人体微量元素的“防癌之王”。

抗氧化作用：

硒是谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分，每摩尔的中含4克原子硒，此酶的作用是催化还原性谷胱甘肽与过氧化物的氧化还原反应，所以可发挥抗氧化作用，是重要的自由基清除剂（是维生素E的50～500倍）。在体内，谷胱甘肽过氧化物酶与维生素E抗氧化的机制不同，两者可以互相补充，具有协同作用。

科学证实：正是由于\"硒\"的高抗氧化作用，适量补充能起到防止器官老化与病变，延缓衰老，增强免疫，抵御疾病，抵抗有毒害重金属，减轻放化疗副作用，防癌抗癌。 增强免疫力：

有机硒能清除体内自由基，排除体内毒素、抗氧化、能有效的抑制过氧化脂质的产生，防止血凝块，清除胆固醇，增强人体免疫功能。

防止糖尿病：

硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛β细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状。

防止白内障：

视网膜由于接触电脑辐射等较多，易受损伤，硒可保护视网膜，增强玻璃体的光洁度，提高视力，有防止白内障的作用。

防止心脑血管疾病：

硒是维持心脏正常功能的重要元素，对心脏肌体有保护和修复的作用。人体血硒水平的降低，会导致体内清除自由基的功能减退，造成有害物质沉积增多，血压升高、血管壁变厚、血管弹性降低、血流速度变慢，送氧功能下降，从而诱发心脑血管疾病的发病率升高，然而科学补硒对预防心脑血管疾病、高血压、动脉硬化等都有较好的作用。

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防止克山病、大骨节病、关节炎：

缺硒是克山病、大骨节病、两种地方性疾病的主要病因，补硒能防止骨髓端病变，促进修复，而在蛋白质合成中促进二硫键对抗金属元素解毒。对这两种地方性疾病和关节炎患者都有很好的预防和治疗作用。

解毒、排毒：

硒与金属的结合力很强，能抵抗镉对肾、生殖腺和中枢神经的毒害。硒与体内

的汞、铅、锡、铊等重金属结合，形成金属硒蛋白复合而解毒、排毒。 防治肝病、保护肝脏：

我国医学专家于树玉历经16年的肝癌高发区流行病学调查中发现，肝癌高发区的居民血液中的硒含量均低于肝癌低发区，肝癌的发病率与血硒水平呈负相关。她在江苏启东县对13万居民补硒证实，补硒可使肝癌发病率下降35%，使有肝癌家史者发病率下降50%。

1.3.2 生物样品中硒含量检测方法的研究进展[3]1.3.2.1 原子光谱分析方法 1.3.2.1.1 原子发射光谱法

原子发射光谱法主要有电感祸合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)和氢化物发生-原子发射光谱法(HG-AES)。ICP-AES法灵敏度高、化学干扰少、线性范围宽、方便快捷，可进行多种微量元素的同时测定。

HG-AES法测定硒时，生物样品中硒必须转化为Se(IV)，它是唯一能形成H2Se的价态，所以与该技术联用的分析方法可以进行硒的价态分析。HG联用ICP-AES可显著提高灵敏度。

1.3.2.1.2 原子吸收光谱法(AAS)

AAS分析法样品预处理简单，取量少，灵敏度高，该方法已成为测定生物样品中硒的主要方法之一。测硒主要有石墨炉原子吸收法(GF-AAS)和氢化物发生一原子吸收法(HG-AAS)GF-AAS法灵敏度高，但基体干扰复杂。消除基体-干扰和选择最佳条件是测定结果可靠性的关键。消除基体千扰以及减少硒损失的主要措施有：使用基体改进剂、塞曼背景扣除、热解石墨涂覆处理等。其中基体改进技术简单有效最

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为常用，它是将基体转变为易挥发物质或者使硒转变为热稳定化合物，以提高原子化温度从而消除背景吸收及减少硒的挥发。塞曼背景扣除主要消除对测硒光谱干扰最大的铁和磷。

M.L.Mena[4]等用该法测定了酵母中的硒。流动注射(FIA)与之联用后，在保持精密度前提下，不仅大大提高了分析速度，且提高了灵敏度。[5]

柏宁，刘惠麒利用氢化物原子吸收光度法发中硒元素测定具有快速、简便、准确、仪器投资成本低，易于临床推广。方法：该法利用氢化物原收光度法，以人体头发为标本，通过酸化提取骤，以原子吸收方法对硒直接测定。结果回收度范围97.2% ～100.3%。平均回收率98.4%。S=1.303，RSD=1.3%，酸度测定对结果无干扰[6]。

常桂英以平菇为载体，通过在培养基中加入一定质量浓度的无机硒溶液进行富硒栽培，获得了富硒平菇。选用和高氛酸(5：1)混合消化液对样品进行湿法消化，采用火焰原子吸收光谱法直接测定平菇、富硒平菇中铁、锰、锌、铜的含量，再运用原子荧光光语法测定这二种平菇中硒的含量。结果表明，富硒平菇含有较高的硒和微量元素 [7] 。

1.3.2.1.3 原子荧光光谱法(AFS)

AFS与原子吸收、原子发射光谱和分子荧光光谱相比，谱线简单，灵敏度更高，光谱干扰少，特别适用于多种痕量元素的同时测定。HG技术与AFS的联用大大地降低了检出限，提高了准确度。Rosa等用HG-AFS测定了尿中微量硒，检测限1.4 μg/L，RSD为3%。

宋凡和曾勇用原子荧光法测定饲料添加剂及预混料中微量元素硒，硒的相对标准偏差为1.2 %，检出限为0.4 ng/mL，线性范围为0～400 ng/mL，相关系数为0.999

[8]

9，回收率为96.1 %～101.8 % 。

1.3.2.2 分子光谱分析方法 1.3.2.2.1 分子荧光光谱法

分子荧光法是较成熟的测硒方法，是基于Se(IV)与2，3-二氨基萘(DAN)及其衍生物形成的Se－DAN类配合物受激发能产生荧光的原理，准确度和灵敏度都高，可用于硒价态分析，适测范围广。该法对酸度和温度要求严格，Karin等用518nm

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波长激发，于577nm处测定荧光强度对生物样品中硒进行了测定，提高了测定速度且反应可耐高酸和高温，检测限为0.6ng/g [9] 。现有很多荧光新技术如导数荧光、形成包合物、荧光碎灭等，提高了测硒的灵敏度、选择性和稳定性。

黄敏文等应用2，3-二氨基萘荧光分光光度法测定了富硒香菇中的硒含量，本研究表明，普通香菇中硒含量为0.45%，富硒香菇中硒含量为6.52%，可见富硒香菇的含硒量约为普通香菇的15倍 [10] 。

刘成雄，杨长庆研究了以罗丹明B作显色剂， 吐温-80作表面活性剂，用分光光度法测定大蒜中的硒。在pH=3.6的邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲溶液中，硒与硫氰酸盐及罗丹明B形成稳定的三元络合物，其最大吸收波长是606 nm;硒在0～0.10μg/mL范围内符合朗伯比耳定律，摩尔吸光系数ε=5.1×105L·mol-1·cm-1。方法的回收率在96.00%～104.0%之间 [11] 。

孙淑华参照最新的国家标准GB/T5009.93-2003食品中硒的荧光测定法，对大米中硒的含量进行了检测，并在测定实践中对操作细节做了一些改进，收到了良好的效果。本次测定是经过较长时间的反复试验，最后取得准确结果。试验的标准差S值0.001903、变异系数CV值2.24％，其数值相当小，说明和真值最接近。还有相关系数r＝0.9972，回收率98.2％，都显示了方法和结果呈较强的正相关性 [12] 。 1.3.2.2.2 分子吸收光度法

分子吸收光度法是利用Se(Ⅳ)与3，3-二氨基联苯胺(DAB)或双硫腙（2S）等形成的配合物的吸收光谱来进行硒的测定。分子吸收光度法灵敏度和选择性较其它测硒方法差，但通过形成多元配合物和利用胶束增溶，采用Se－碱性染料(如罗丹明类)－碘化物(或硫氰酸盐、杂多酸)－水溶性高分子(如吐温或明胶等)形成高灵敏度显色离子缔合物体系，应用于对生物样品中硒的测定，其效果与其它方法并不逊色。

1.3.2.3 电化学分析方法

电化学分析方法在测定生物样品中微量硒方面较其它方法有灵敏度高、方便快速、仪器便宜、选择性好。目前硒测定中主要的电化学方法有溶出伏安法和极谱法。

溶出伏安法使灵敏度显著提高是由于它能电解富集硒的作用。Recai等用微分脉冲阴极溶出伏安法和微分脉冲阳极溶出伏安法分别对牛奶中硒和铅的含量进行

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了同时测定。测硒的线性范围和相关系数分别为0.5～1.2 μg/L 和0.9981。 1.3.2.4 活化分析

活化分析包括X射线荧光分析(XRF)和中子激活分析法(NAA)，是非损坏性的多元素分析方法。XRF的分析测定元素范围广，精确度高，重现性好，分析速度快。刘树文等用x射线荧光法对动物饲料中微量硒进行了测定，最低检测限0.2 μg /g，回收率为96士4.6%。检出限为0.1 μg /g。NAA是一种核分析方法，灵敏度非常高、准确度和精密度好。Marian则用NAA法测定了小鼠的肝肺样品中微量硒。采用放射后化学分离法消除其它放射核素干扰，分离效率95士3%，用Ge(Li)检测器检测，检测限可达0.lng。但是NAA法设备价格昂贵，技术程度高，分析速度并不快，目前使用并不多。 1.3.3 紫外-可见分光光度法

1.3.3.1 紫外-可见分光光度法简介[13][14]

紫外-可见分光光度法是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析， 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。

按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σn→σ 、电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。跃迁类型有：σ→σ、π→π*、 n→π* 四种。饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱和机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。

例如

（1）邓斌等采用紫外分光光度法，以邻苯二胺盐酸盐做显色剂，检测波长为335 nm，测定石榴皮中微量硒元素的含量。结果表明，吸收度与浓度之间呈良好线性方程(r=0.9993) ，9种不同产地来源石榴皮中的微量硒元素含量在2.11～8.65μg/g之间，加标平均回收率98.4%，RSD为0.31%。该方法具有操作简便、测定快速、灵敏度高、稳定性好等显著优点，适用于测定石榴皮样品中微量硒含量 [15] 。

*

*

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（2）徐暄以邻苯二胺为显色剂，采用紫外分光光度法检测樱桃番茄中硒的含量。结果表明，樱桃番茄中硒的平均含量为0.674μg/g，加样回收率为98.3% [16] 。

（3）王安琪等用紫外分光光度法对几种市售食用菌中硒含量进行了测定.以硫酸-高氯酸作为消化剂，邻苯二胺替代3，3-二氨基联苯胺，在硒含量为6～30μg范围内对平菇所做的重复性实验和回收率实验都有较好的效果.对市售平菇、双孢蘑菇、香菇、姬菇、金针菇等5种食用菌中硒含量测定结果分别为18.74，33.47，22.68，23.27，20.70μg/g，为富硒食用菌栽培提供了参考 [17] 。

（4）周件贵和辛国爱采用紫外分光光度度法，以邻苯二胺盐做显色剂，检测波长为335nm。结果12个不同产地来源陈皮中的硒元素含量在2.36～9.83μg/g之间，平均回收率97.9 %。本法简单实用，数据可靠 [18] 。

（5） 刘茹，马森用硒—邻苯二胺紫外分光光度法测定了武夷岩茶、小红袍、铁观音和绿茶中硒含量，并做了重复试验和回收试验，结果：武夷岩茶小红袍、铁观音、绿茶中硒含量为18. 87±4. 12、18. 65±4. 85、12. 70±1. 76、13. 70±3. 54(μg/100g);重复试验的C. V在13. 86% ～26. 04%之间;回收率97. 62% [19] 。

（6）彭晓俊，邓爱华，秦汉建立了用紫外分光光度法测定海产品中Se含量的方法，结果表明，在选定的实验条件下， Se的浓度和吸光度呈良好的线性关系，标准曲线的相关系数为0. 9990，对海带所做的试验，平均回收率为96. 3%，稳定性RSD为0. 96%，对海带、对虾、海藻等海产品中Se含量测定结果分别为0. 105、

-1 [20]

0. 436、0.0786μg·g。此法准确、重现性好、操作简单 。

1.3.3.2 红移和紫移

在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为紫移。 1.3.3.3 有机化合物的吸收带

吸收带(absorption band)： 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。R吸收带；K吸收带；B吸收带；E吸收带。

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1.3.3.4 无机化合物的紫外-可见吸收光谱 1.3.3.4.1 f电子跃迁吸收光谱

镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。

1.3.3.4.2 d电子跃迁吸收光谱

过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。例如 Cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。 1.3.3.4.3 电荷迁移光谱

某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。 1.3.3.5 影响紫外-可见吸收光谱的因素

物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。

温度在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。 1.3.4朗伯-比尔定律 1.3.4.1 吸光度和透光度

设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为 It，反射光强度为Ir，则I0= Ia+ It。

I0= Ia+ It+ Ir由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：

透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示： 即 T= It/I0。

吸光度：为透光度倒数的对数，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It。

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1.3.4.2 朗伯-比尔定律[21][22]

朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即A=KCL式中比例常数K与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。C为吸光物质浓度，L为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 1.3.4.3 吸光系数

当l以cm，C以g/L为单位，k称为吸光系数，用a表示。A=kCl。k的单位为L/(g.cm)。

1.3.4.4 摩尔吸光系数

当l以cm，c以mol/L为单位，K称为摩尔吸光系数，用 ε表示。ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。

1.4 研究的基本内容，拟解决的主要问题

查阅有关硒元素对人体健康的研究进展以及微量硒元素含量分析的中外文文献。采用邻苯二胺做显色剂， 利用简单的分光光度法， 对硒标准溶液进行测定。选择适宜的UV-VIS分析条件并优化UV-VIS分析条件（样品提取方法和UV-VIS分析的最大吸收波长、酸度、显色时间、稳定性、抗干扰性等），建立并考察工作曲线，测定回收率、RSD等考察分析方法的可靠性并用于实际样品分析。

1.5 研究步骤、方法

第一步，确定硒元素的最大吸收波长，进行条件实验，确定实验条件范围。 第二步，进行正交试验，选定最优化条件后做工作曲线。

第三步，建立UV-UIS测定硒元素的分析方法，考察工作曲线的线性范围和最小检出限。

第四步，分别从对工作曲线进行线性回归，导出线性回归方程，求出相关系数、做回收率实验和求RSD，考察UV-UIS方法的可靠性。

第五步，用UV-UIS测定样品中硒的含量，并作回收率实验。

紫外分光光度法测定富硒米中硒的研究

第二章 实验内容

2.1实验试剂

2.1.1 硒标准溶液（30μg/mL）

硒标准储备液： 0.1mg/g滴定用硒标准溶液。

硒标准溶液：取硒标准储备液30.0mL于100mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度线，此溶液即为硒标准溶液。 2.1.2 其他试剂

NaOH；8mol/LNaOH溶液;磷酸； 1:1(V/V)磷酸溶液;；40%盐酸羟胺溶液;0.2 mol/LEDTA溶液; 0.2%邻苯二胺溶液（用前现配）；0.067g/ml钼酸钠溶液；高氯酸；甲苯。试剂均为分析纯,所用水均为去离子水。试剂厂家见表2-1实验试剂。

表2-1实验试剂 实验试剂

试剂

硒标准溶液 邻苯二胺 钼酸纳 氢氧化钠 盐酸羟胺

乙二胺四乙酸二钠 甲苯

级别 A.R. A.R. A.R. A.R. A.R. A.R. A.R.

产地

天津市津科精细化工研究所 天津市福晨化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 北京化工厂

天津市福晨化学试剂厂 北京化工厂 北京化工厂

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2.2实验仪器

HITACHI UV-2800型分光光度计;10mm石英比色皿;PH计;万用电炉；及常用玻璃仪器。生产厂家见表2-2实验仪器。

表2-2实验仪器 实验仪器

设备名称

U-2800 紫外－可见分光光度计

PHS-2F型酸度计 AL204-IC型电子天平 DH－201 电热恒温干燥箱

生产厂家 HITACHI 上海雷磁仪器厂

METTLER TOLEDO 仪器上海有限公司 天津市中环实验电炉有限公司

2.3实验方法

2.3.1测定最大吸收波长

用移液管吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，置于250mL三角瓶中，加去离子水35 mL，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，1mL0.2mol/LEDTA溶液，2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，加2 mL0.2%邻苯二胺溶液，摇匀后静置2h。

2h后，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上测其吸光度值，用10mm的比色皿，以试剂空白作对照，在200～500nm之间，扫描最大吸收波长，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，从而选择测量硒的适宜波长。 2.3.2 条件实验

2.3.2.1 显色剂浓度的影响

取6只250mL三角瓶，各吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，分别加1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL0.2%邻苯二胺溶液，摇匀后静置2h。加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上分别测其吸光度值，以显色剂邻苯二胺的体积（mL）为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制吸光度A-试剂

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用量曲线，以确定测定过程中，显色剂的用量。 2.3.2.2 有色溶液的稳定性

取6只250mL三角瓶，各吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，加入2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，加2.0mL0.2%邻苯二胺溶液，摇匀后分别静置10min、20min、30min、1h、2h、3h。加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液立刻在333nm波长下，用10mm比色皿，用相应的试剂溶液为空白，测定吸光度。绘制 A-t曲线，判断此络合物稳定性的情况。

2.3.2.3 溶液酸度的影响

在4只250mL溶液瓶中，分别加入1mL 30μg/mL标准硒溶液，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，加入2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，加2.0mL0.2%邻苯二胺溶液，分别滴加NaOH溶液至PH=1、PH=2、PH=3、PH=4。摇匀后静置2h，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于333nm波长下，用10mm比色皿，以各自相应的试剂溶液为空白，测其吸光度。绘制A-pH曲线，确定最适宜pH区间。

2.3.2.4 还原剂用量的测定

取4只250mL三角瓶，各吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，加NaOH溶液至pH为中性，加2.0mL0.2%邻苯二胺溶液，1mL0.2mol/LEDTA溶液，2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，分别加1.0、2.0、3.0、4.0mL40%盐酸羟胺溶液，摇匀后静置2h，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上测其A值，以还原剂盐酸羟胺的体积（mL）为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制吸光度A-试剂用量曲线。

2.3.2.5 抗干扰剂EDTA的用量测定

取4只250mL三角瓶，各吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，加NaOH溶液至pH为中性，加2mL40%盐酸羟胺溶液，2.0mL0.2%邻苯二胺溶液，2mL1:1(V/V)磷酸溶液，摇匀，分别加1.0、、2.0、3.0、4.0mL0.2mol/LEDTA溶液，摇匀后静置2h，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上测其A值，以显色剂邻苯二胺的体积（mL）为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制吸光度

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A-试剂用量曲线。 2.3.3 正交试验

取9只250mL三角瓶，各吸取1mL 30μg/mL标准硒溶液，加NaOH溶液至pH为中性，按下表加入试剂，摇匀后静置2h，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上测其A值。

表2-3正交试验 正交实验表

显色剂浓度

因素

（mL）

实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9

2.00 2.00 2.00 3.00 3.00 3.00 4.00 4.00 4.00

2.00 3.00 4.00 2.00 3.00 4.00 2.00 3.00 4.00 PH值

（mL） 1.00 2.00 3.00 2.00 3.00 1.00 3.00 1.00 2.00

（mL） 1.00 2.00 3.00 3.00 1.00 2.00 2.00 3.00 1.00

0.259 0.233 0.161 0.223 0.232 0.201 0.270 0.295 0.299

还原剂用量

抗干扰剂用量

吸光度（A）

2.3.4 标准曲线 2.3.4.1 标准曲线的绘制

取9只250mL三角瓶，分别加入30mL去离子水，分别移取硒标准溶液0.05mL、0.10mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、2.0mL，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，加入4.0mL邻苯二胺溶液，滴加1:1磷酸溶液调节pH=4，摇匀后静置2h。加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上分别测其吸光度值，以加入的硒的质量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，以确定样品中所含硒含量。

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2.3.4.2 标准曲线的回收率实验

取5只250mL三角瓶，分别加入30mL去离子水，分别移取硒标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，加入4.0mL邻苯二胺溶液，滴加1:1磷酸溶液调节pH=4，摇匀后静置2h。加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上分别测其吸光度值，以其吸光度值利用标准曲线求加入质量，与实际质量求回收率。 2.3.4.3标准曲线的精密度实验

取6只250mL三角瓶，分别加入30mL去离子水，分别移取硒标准溶液1mL，加入2mL40%盐酸羟胺溶液，加入1mL0.2mol/LEDTA溶液，加入4.0mL邻苯二胺溶液，滴加1:1磷酸溶液调节pH=4，摇匀后静置2h。加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外分光光度计上分别测其吸光度值，以其吸光度值求RSD。 2.3.5 样品分析 2.3.5.1 样品前处理

将从市场上买来的富硒米样品洗去表面杂质后，在蒸馏水中浸泡15 min，再用蒸馏水冲洗3次，用干净的纱布吸干表面的水分后，在55℃烘箱中烘干至恒重，在干燥器中冷却，然后用研钵将样品粉碎，储存在干燥器中备用。 2.3.5.2 样品的测定

准确称取处理好的富硒米样品1.000g于250mL三角瓶中，加3:4(V/V)磷酸高氯酸消解液21mL，在室温下放置，至瓶中内容物为糊状时，加入3mL钼酸钠溶液，轻轻平行摇匀，置于万用电炉上加热，加热至激烈反应后，继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡黄色为止，取下冷却，加蒸馏水35 mL，加分析纯NaOH至中性，加2mL40%盐酸羟胺溶液，1mL0.2mol/LEDTA溶液，滴加 1:1(V/V)磷酸溶液至PH=4，摇匀，加4mL0.2%邻苯二胺溶液，摇匀后静置2h，加10mL甲苯，摇动1min，静置10min，取上清液于紫外波长333nm处测其A值.处理样品的同时，用空白做对照。 2.3.5.3 样品的回收率实验

在1.000g富硒米样品中加入0.2mL硒标准应用液，相当于6μg的硒含量，按样品的消化和硒含量测定过程，测定其333 nm处的吸光度，代入回归方程算出含

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硒量，计算其回收率。

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第三章 结果与讨论

3.1硒标准溶液条件优化实验的结果与讨论

3.1.1测定最大吸收波长

按照2.3.1的实验方法，扫描得到该反应条件下的Se标准溶液吸收曲线，如图3-1。

图3-1最大吸收波长

由图3.1可知硒标准溶液的最大吸收峰为333nm，其最大吸光度为0.535。

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3.1.2 条件实验

3.1.2.1 显色剂浓度的影响

按照2.3.2.1的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定不同添加量的邻苯二胺溶液吸光度值，得到的结果如表3-1。

表3-1邻苯二胺加入量 显色剂邻苯二胺加入量的选择

邻苯二胺的体积（mL）

吸光度（A）

1.0 0.324

1.5 0.304

2.0 0.343

2.5 0.353

3.0 0.356

4.0 0.360

图3-2邻苯二胺添加量

邻苯二胺的添加量在2.0ml～4.0ml范围内吸光度较高。

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3.1.2.2 有色溶液的稳定性

按照2.3.2.2中的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定显色反应时间不同的溶液的吸光度值，得到的结果如表3-2。

表3-2溶液稳定性 有色溶液的稳定性

t A

10min 0.417

20min 0.171

30min 0.79

1h 0.669

2h 0.922

3h 1.003

图3-3溶液稳定性

从图中可以看出反应时间在30min～1h区间内已经稳定，但吸光度较小。2h后，吸光度值稳定且较高，因此选择反应时间2h。

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3.1.2.3 溶液酸度的影响

按照2.3.2.3的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定不同pH值溶液的吸光度值，得到的结果如表3-3。

表3-3PH值得选择 PH值的选择

PH值 吸光度（A）

1 0.222

2 0.312

3 0.302

4 0.288

图3-4PH值得选择

将显色反应的酸性环境pH值控制在2.0～4.0时吸光度较稳定，基本保持不变。

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3.1.2.4 还原剂用量的测定

按照2.3.2.4的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定不同添加量的盐酸羟胺溶液的吸光度值，得到的结果如表3-4。

表3-4还原剂加入量

还原剂盐酸羟胺加入量的选择

盐酸羟胺体积（mL）

吸光度（A）

1.0 0.461

2.0 0.439

3.0 0.348

4.0 0.329

图3-5还原剂加入量

添加40％盐酸羟胺溶液的含量在1.0ml～2.0ml范围内时，吸光度较高。

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3.1.2.5 抗干扰剂EDTA的用量测定

按照2.3.2.5的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定不同添加量的EDTA溶液的吸光度值，得到的结果如表3-5。

表3-5抗干扰剂加入量 抗干扰剂EDTA加入量的选择

EDTA体积（mL）

吸光度（A）

1.0 0.325

2.0 0.333

3.0 0.333

4.0 0.332

图3-6抗干扰剂加入量

添加0.2mol/LEDTA溶液的含量在2.0ml～4.0ml时吸光度较稳定，基本保持不变。

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3.1.3正交试验

按照2.3.3的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定溶液的吸光度值，得到的结果如表3-6。

表3-6正交试验

正交实验

显色剂浓度

因素

（mL）

实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9 均值1 均值2 均值3 极差 条件实验

2.00 2.00 2.00 3.00 3.00 3.00 4.00 4.00 4.00 0.218 0.219 0.288 0.070 4.000

2.00 3.00 4.00 2.00 3.00 4.00 2.00 3.00 4.00 0.251 0.253 0.220 0.033 2.000 PH值

（mL） 1.00 2.00 3.00 2.00 3.00 1.00 3.00 1.00 2.00 0.252 0.252 0.221 0.031 1.000

（mL） 1.00 2.00 3.00 3.00 1.00 2.00 2.00 3.00 1.00 0.263 0.235 0.226 0.037 2.000

0.259 0.233 0.161 0.223 0.232 0.201 0.270 0.295 0.299

还原剂用量

抗干扰剂用量

吸光度（A）

通过正交试验，可以看出最优的实验条件是第九组实验，即显色剂邻苯二胺加入量为4.0mL，还原剂盐酸羟胺加入量为2.0mL，抗干扰剂EDTA的加入量为1.0mL，PH值为4.0。

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3.1.4 标准曲线 3.1.4.1 标准曲线的绘制

按照2.3.4.1的实验方法，用U-2800分光光度计在333nm波长下分别测定溶液的吸光度值，绘制标准曲线，试验数据见表3-7：

表3-7标准曲线

标准曲线

硒标液体积V（mL） 硒标液的硒含量m

（μg） A1 A2 A3 平均值 校正值

0.072 0.107 0.138 0.106

0

0.0950.1350.1570.1290.023

0.1460.1560.1690.1570.051

0.1560.1660.1780.1670.061

0.2610.2660.2700.2660.160

0.319 0.335 0.341 0.331 0.225

0.376 0.407 0.411 0.398 0.292

0.4820.4850.49 0.4870.381

0.8280.8380.8410.8360.730

0 0

0.05 1.5

0.1 3

0.2 6

0.4 12

0.6 18

0.8 24

1.0 30

2.0 60

图3-7标准曲线

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标准曲线的线性回归方程及相关系数 Y = A + B * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------ A 0.00485 B 0.01216

0.00445 1.78697E-4

由上图可以看出，硅的含量在6.000～60.00mg/L呈现良好线性关系，校正曲线的线性回归方程为：

Y=0.01216X+0.00485 其线性相关系数为0.9992。 3.1.4.2 标准曲线的回收率实验

按2.3.4.2进行回收率的测定，数据如表3-8：

表3-8 回收率实验结果

标准曲线的回收率

实际加入质量（g） 吸光度值A 实验计算质量（g） 回收率（%）

6 0.061 4.618 76.97%

12 0.160 12.76 106.3%

18 0.225 18.10 100.6%

24 0.292 23.61 98.38%

30 0.381 30.93 103.1%

由此可见，标准品的回收率在98.38%～106.3%之间，平均回收率达到102.1%

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3.1.4.3标准曲线的精密度实验

按2.3.4.3进行精密度的测定，数据如表3-9：

表3-9精密度实验实验结果

精密度测定

编号 硒标液加入量（mL） 吸光度A

0.081

0.081

0.083

0.082

0.082

0.082

1 1.0mL

2 1.0mL

3 1.0mL

4 1.0mL

5 1.0mL

6 1.0mL

X=0.082 S=0.0000004

RSD=S/X*100%=0.0000004/0.082*100%=0.7713%

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3.2样品分析

3.2.1未知样品的测定

按2.3.5.2的实验方法，测定未知样品数据如表3-10：

表3-10未知样品测定结果

重复性实验结果

编号 1 2 3 4 5 平均值

样品量/g 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 10.18

A3330.122 0.129 0.130 0.130 0.132

含量μg/g 9.634 10.21 10.29 10.29 10.46

由表计算出的浓度可知，市售富硒米的平均计算含量为10.18 μg/g。 3.2.2 回收率实验

按2.3.5.3的实验方法，测定未知样品数据如表3-11：

表3-11回收率实验结果

回收率实验结果

编号 1 2 3 4 5 平均回收率

添加量/μg

6.0 6．0 6．0 6．0 6．0 109.7%

回收量/μg 6.661 6.496 6.581 6.581 6.575

回收率/% 111.0% 108.3% 109.7% 109.7% 109.6%

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通过测定其333 nm处的吸光度，代入回归方程算出含硒量，计算得到样品加标回收率为109.7%。

3.3讨论

3.3.1邻苯二胺试液的浓度及反应时间

0.2%邻苯二胺溶液，容易氧化变质，因此必须用前现配。 3.3.2还原剂的时效

还原剂盐酸羟胺同样需要用前现配，时间长会氧化失效。 3.3.3 pH的影响

邻苯二胺在酸性介质中与亚硒酸盐反应生成一种络合物，反应溶液的pH值必须控制在2～4之间，酸度过高或过低都不利于苯骈硒二唑的形成， 因此pH对本实验的影响很大。Ariyoshi采用80%甲酸在酸度计下调节，经实验改为1:1磷酸，选用适当的pH指示剂调节pH值，简便易行，结果一致。 3.3.4 实验的准确度

在做标准曲线时，所取的最大硒含量达到60μg，硒含量在6.000～60.00μg范围内线性均较好，R=0.9992，说明用该方法所测得的吸收值，在硒含量为6.000～60.00μg的范围内，与硒含量成正相关。回收率实验中，标准品的回收率在98.38%～106.3%之间，平均回收率达到102.1%，相对标准偏差为0.7713%，有较好的准确性和精密度。 3.3.5 前处理的注意事项

实验中，样品的消化需要仔细观察(置于电炉上，加热至激烈反应后，继续加热至产生白烟，溶液逐渐变成淡黄色为止)。在电炉温度趋于稳定后，可对消化进行定时(本文定为4 min)，以保证消化程度的一致。加热过程中产生的白烟有刺激性，可在瓶口加4层报纸覆盖一下，可较好的防止白烟的扩散。另有文献[17]指出硫酸本身含有硒，我们也曾用标准品不经过消化过程来进行测定，发现A值确实偏低，因此在实验过程中试用磷酸代替硫酸，实验结果令人满意。

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3.3.6 萃取剂的挥发性

用甲苯做萃取剂时，由于甲苯具有挥发性，因此重复测量时，会由于挥发使测定值不断增大。因此一定要尽快测量，以减小误差。

通过本法测量硒，回收率的测定实验结果表明，本法回收率在98.38%～106.3%之间，有较好的准确度。精密度的测定实验结果表明，本法的RSD为0.7713%，具有较好的精密度。证明本法适合一般分析需要。

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第四章 结论与展望

4.1 结论

通过本法找到分光光度法测量硒含量的最优条件，在1.0mL30μg/g的硒，在pH值为4.0的条件下用0.2%的邻苯二胺来与之反应显色，加入2mL还原剂盐酸羟胺，1mL抗干扰剂EDTA，静置2h。结果表明，在波长333nm处有最大吸收峰，硒含量在6.000-60.00μg/g范围内遵守比尔定律，通过测定回收率、精密度发现本法准确性较高，可以适用于一般分析需要。通过对样品的实验发现本法用于富硒米中硒的研究，取得了较好结果。本法具有简便、快速等特点。

4.2 对进一步研究的展望

本实验对用分光光度法测量硒含量的显色时间、显色环境、显色剂用量、还原剂用量等条件进行了研究，通过工作曲线的测绘，回收率，精密度的实验验证了分光光度法测量富硒米中硒含量的可行性，并取得较为满意的结果，为下一步的研究工作奠定了良好基础。

进一步的研究工作主要是通过改进样品处理方法，尽可能的将米中的硒完全溶解。以及在与其他常用硒测定方法对比、改进，以期最大限度减小误差，提高准确度。

紫外分光光度法测定富硒米中硒的研究

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