实验一 纸层析法分离氨基酸

一、实验目的

1．掌握纸层析的基本技术

2．学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸

二、实验原理

纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法：利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数、经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数：

层析溶剂(亦称展层剂或推动剂)是选用特定的有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(葡萄糖基的-OH基能与H2O通过氢键相互作用)，能吸附很多水分(可达22%滤纸重，其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，这部分被吸附的水因扩散作用降低而形成固定相。反之，展层剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动而形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入展层剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其的溶质依据自身的分配系数在这两相间不断进行分配，即随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，结果使溶质离开原点不断向前移动。由于溶质中各组分的分配系数不同，导致前行中出现移动速率差异，因而通过一定时间的层析，样品中的不同组分即可实现分离。 层析中某物质的移动速率以Rf值表示：

各种化合物在恒定条件下，层析时都有其一定的Rf值，借此可达到定性、鉴别的目的。 应当注意的是，溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度和时间等因素都会影响Rf值。

三、实验器材

1．实验仪器

培养皿、毛细管、滤纸、喷壶、电吹风 2．试剂

（1）6mol／L HCl

（2）若干种氨基酸标准液(l mg/mL)，混合样液 （3）展层剂：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 (V/V) （4）0.5％茚三酮溶液

四、实验步骤

1、每人取圆形滤纸一张，将滤纸沿直径对折两次后展开。 2、在折出的四条半径上，离圆心约0.5cm处用铅笔标记出点样点。

3、用毛细管吸取氨基酸样品，置于点样点处，待自然晾干后，重复点样三次。

4、剪一小条长方形滤纸，卷成小纸筒，用剪刀把纸筒一端剪开成细条并压平，用纸筒另一端穿过圆形滤纸的圆心。

5、把纸筒的细条端放入培养皿的层析液中，将培养皿盖好，静置约30min。 6、打开培养皿，取出圆形滤纸，立刻标出扩展剂外沿。 7、用电吹风把圆形滤纸吹干。

8、用喷壶在圆形滤纸表面均匀喷洒显色剂，完全吹干后显色。

五、实验结果

1、计算各标准氨基酸样品的Rf值

2、与标准氨基酸的Rf值对照，确定混合样品中含有哪些氨基酸。

六、注意事项

1、点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。

2、点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。

3、展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。

七、思考题

1、为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2、该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果？