食品研究与拜发 基础研究 ＤＯＩ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００５—６５２１．２０１３．０６．００３ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ １）ｅｖｅｌｏｏｍｅｎｔ ２０１３年３月 第３４卷第６期 ９ 山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化 作用研究 王晓波。李金芳，王梅，邹志辉，刘冬英。陈海珍 （广东药学院公共卫生学院，广东广州５１０３１０） 摘要：对山竹壳总黄酮的抗氧化作用及对亚硝化反应的抑制作用进行研究。采用超声辅助热水浸提的方法提取山 竹壳中的黄酮类化合物，以芦丁为标准物质来测定提取物的总黄酮含量，通过水杨酸法测定山竹壳总黄酮对羟自由 基的清除作用、邻苯三酚自氧化法测定山竹壳总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用，以评价山竹壳总黄酮的抗氧 化能力；并通过用分光光度法测定山竹壳总黄酮对亚盐的清除率和对亚硝胺合成的阻断率，以评价山竹壳总黄 酮对亚硝化反应的抑制能力。采用超声辅助热水浸提方法提取的山竹壳提取物中总黄酮的含量为４２．３６％，该类化合 物对羟自由基和超氧阴离子自由基具有一定的清除作用，随反应浓度增加清除率增大；在模拟人体胃液的条件下 （ＤＨ ３．０、温度３７℃），山竹壳总黄酮能有效地清除亚盐和阻断亚硝胺合成，随反应浓度增加清除率和阻断率增 大。山竹壳总黄酮具有一定的抗氧化作用及抑制亚硝化反应的作用。 关键词：山竹壳；总黄酮；抗氧化；抑制亚硝化反应 Ｔｈｅ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ Ｓｈｅｌｌ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｂｏ，ＬＩ Ｊｉｎ－ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ Ｍｅｉ，ＺＯＵ Ｚｈｉ－ｈｕｉ，ＬＩＵ Ｄｏｎｇ—ｙｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｈａｉ—ｚｈｅｎ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，Ｇｕａｎｇ Ｄｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３１０，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｆｒｏｍ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｈｕｌｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｒｕｔｉｎ ａｓ ｔｈｅ 作者简介：王晓波（１９６１一），女（汉），教授，硕士，研究方向：食物营养与天然物质功效成分。 由表７可知，展望组合的试验结果数据稍优于第 ８组。 参考文献： ［１】郑键仙．功能性食品［Ｍ】．北京：中国轻工业出版社，１９９５：３４７－３５２ 【２］余奕珂，胡建恩，白雪芳，等．以猪血为蛋白源的生物活性肽的研 ３结论 究进展『Ｊ１．精细与专用化学品，２００４，１２（１８）：１０—１３ Ｉ ３ 戴玉锦．３ｌ生物化学［Ｍ］．北京：高等教育版社，１９９２：３５３—３５９ ［４］刘勇．玉米蛋白ＡＣＥＩ活性肽的研究【Ｄ］．镇江：江苏大学硕士学位 论文，２００５：３３ 试验以ＦＲＡＰ法测定酶解液Ａ 作为总抗氧化能 力指标，考察了５种不同商业蛋白酶的酶解效果，最终 确定定Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ Ｎｅｕｔｒａｌ细菌中性蛋白酶作为试验用 酶。试验选取ｐＨ、加酶量、底物浓度和酶解时间４个因 ［５］徐霞．大蒜ＡＣＥＩ活性肽制备技术的研究［Ｄ］．镇江：江苏大学硕士 学位论文，２００５：３９ ｆ６】许申鸿，杭瑚．溶剂及ｐＨ值对１，１一二苯基一２一苦肼基自由基分析 法的影响ｆＪ１．分析测试学报，２０００，１９（３）：５０－５２ ［７］Ｂｅｎｚｉｅ ＩＦＦ，Ｓｔｒａｉｎ ＪＪ．Ｔｈｅ ｆｅｒｒｉｃ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｓ ａ ｍｅａ— 素为试验参数，进行正交试验和验证试验，得到酶法 制备蚕茧层抗氧化肽最优工艺条件：温度６０ ｏＣ，ｐＨ ６－５，加酶量１０％（以底物质量计），底物浓度３．３ １ｏ０ ｍＬ， 酶解时间２１０ ａｒｉｎ。测得该条件下的水解液的总抗氧化 能力 为１．７９５，水解度为４．２３％，固形物含量为 ９．１５ ｍｇ／ｍＬ。 ｓｕｒｅ ｏｆ＂ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｗｅｒ ：ｔｈｅ ＦＲＡＰ ａｓｓａｙ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ— ｉｓｔｒｙ，１９９６，２３９（１）：７０—７６ ［８】许庆陵，曾庆祝，朱莉娜，等．鲢酶解物对羟基自由基的清除作用 ｆＪ１．水产学报，２００４，２８（１）：９３—９９ 收稿日期：２０１２—０７—１６ 王晓波，等：山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 基础研究 一＝＝＝＝ Ｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ，ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆ４２．３６％．ｏｆ ｓｕｃｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｈａｓ ａ ｃｅｒｔａｉｎ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ；ｉｎ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｉｃｅ（ｐＨ ３‘０，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３７℃），ｆｉａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｌｏｃｋ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｎｉｔｒｉｔｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ．Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌａｖｏｎｏｉｆｄｓ ｏｆｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｈａｓ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆＮｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｓａｔｉｏｎ 山竹壳一直作为泰国传统医药用于腹痛、腹泻、 痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡、白带、淋病等疾病 治疗ｌ１ｊ。近年许多研究人员对其进行了化学成分和生 物活性的研究，从中分离出几十种黄酮类化合物，活 性研究发现山竹具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化活性，抗菌 上海亚荣生化仪器厂；ＳＨ２一Ｄ循环水式真空泵：巩义 市予华仪器责任有限公司；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌａｂ ２２ｐｃ可见分 光光度计：上海棱光技术有限公司；ＷＦＨ一２０３紫外分 析仪：上海精科实业有限公司。 １．３实验方法 活性 。近年来大量的流行病学调查、动物实验及体外 实验研究结果表明，生物类黄酮具有广泛的抑癌和防 １．３．１山竹壳总黄酮提取及含量 山竹果，去除果肉，清洗干净，电热恒温干燥箱 ７０℃干燥至恒重，粉碎机粉碎。称取２０ ｇ山竹壳干粉 于２５０ ｍＬ碘量瓶中，加入８０％乙醇２００ ｍＬ，密塞摇 匀，在７０℃恒温中超声浸提２５ ｍｉｎ，置于７０℃水浴 提取１ ｈ，过滤，滤渣重复提取１次，收集滤液，用旋转 蒸发器蒸发浓缩，石油醚脱脂后在电热恒温鼓风干燥 箱８０ ｃｃ干燥，得到山竹壳提取物。 １．３．２芦丁标准曲线制定 癌作用Ｉ３］，亚硝胺是一类明确的化学致癌物，由其前体 仲胺和亚盐合成，尤其是在人和动物胃中更适于 合成亚硝胺能引起人体和动物的肝脏等多种器官的 恶性肿瘤阻断或减少亚硝胺的生成是预防肿瘤发生 的一个重要措施。实验表明，植物中黄酮具有清除亚 盐、抑制亚硝胺合成的作用 。但是对于山竹壳 中黄酮对亚硝化反应的抑制作用未见研究报道，本实 验对山竹壳黄酮类化合物进行提取并对其抗氧化作 用及对亚硝化反应的抑制作用进行研究，为山竹壳的 进一步开发利用提供参考依据。 １材料与方法 采用亚铝比色法测定，精密称取芦丁对照品 ４０ ｍｇ，用８０％乙醇溶液溶解并定容于１００ ｍＬ容量瓶 中。精确吸取０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ置于１０ ｍＬ 比色管中，加５％ＮａＮＯ 溶液０．３ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ，加 １０％ＡＩ（ＮＯ３）３溶液０－３ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ，加４％ＮａＯＨ 溶液４．０ ｍＬ，加水至刻度，摇匀，放置１５ ｍｉｎ，在确定的 测定波长处测吸光值，建立回归方程。 １．３．３山竹壳提取物中总黄酮含量的计算 提取物中黄酮含量＝（ＣｘＶｘ稀释倍数）／ｍ×１００％ 式中：Ｃ为处理后求得的山竹壳总黄酮的浓 １．１材料与试剂 山竹市售：去果肉。芦丁标准品：上海伯奥生物科 技有限公司；三羟甲基氨基甲烷、ａ一萘胺、焦性没食子 酸（ＡＲ）；二甲胺、Ｎ一１一奈乙二胺盐酸盐：ＡＲ天津市科 密欧化学试剂有限公司；无水对氨基苯磺酸、水杨酸 等国产分析纯。 １．２主要仪器 度，（ｍｇ／ｍＬ）；Ｖ为提取液体积，ｍＬ；ｍ为所称取山竹 壳提取物的质量，ｇ。 １．３．４山竹壳总黄酮抗氧化作用的测定 １．３．４．１对羟自由基的清除作用 Ｕ一３０１０紫外可见分光光度计：日本株式会日本高 新技术那珂事业所；ＫＱ一５００Ｅ超声波清洗器：昆山市 超声仪器有限公司；１０１一Ａ数显电热鼓风干燥箱：上海 浦东荣丰科学仪器有限公司；ＲＥ一２０００旋转蒸发器： 按照Ｆｅｎｔｏｎ反应的方法建立反应体系模型，利用 Ｈ２０：与Ｆｅ 混合产生－ＯＨ，水杨酸捕捉・ＯＨ，并产生有 基础研究 王晓波，等：山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 色产物，该产物在５１０ ＨＩＴＩ处有强吸收。在１０ ｍＬ具 塞试管中加入１ ｍＬ ９ ｍｍｏｌ／Ｌ ＦｅＳＯ ￣，１ ｍＬ ９ ｍｍｏｌ／Ｌ水 杨酸一乙醇溶液，１ ｍＬ样品溶液（浓度１ ｍｇ／ｍＬ），混匀 后，加入１ ｍＬ ８．８ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２０ 启动反应，用蒸馏水定 容至１０ ｍＬ，摇匀静置１０ ｍｉｎ后在５１０ ｎｍ处测定其吸 光度Ａ值，以同浓度的样品溶液为对照品，计算清除 率。 清除率：Ｓ＝（Ａ ０一Ａｘ）／ａ ｏ×１００％ 式中：Ａ。为空白对照吸光度；４ 为加入被测物 后吸光度。 １．３．４．２对超氧阴离子自由基的清除作用［１０－１１ 采用邻苯三酚自氧化法。在１０ ｍＬ比色管中加入 ｐＨ＝８．２ Ｔｆｉｓ—ＨＣＩ缓冲溶液２．０ ｍＬ和二次蒸馏水 ７．０ ｍＬ，于２５。【＝恒温２０ ｍｉｎ后加入１．０ ｍＬ ２５℃预热 过的５ ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚（对照管用１０ ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸代 替），迅速摇匀，立即倾入光径１ ｃｍ比色杯中，在波长 ４２０ ｎｍ处每０．５ ｍｉｎ测定１次吸光度Ａ。，共测４ ｍｉｎ。 计算邻苯三酚自氧化管吸光度值随时间的变化率△Ａ。。 样品测定：加入１ ｍＬ样品溶液（浓度１ ｍｇ／ｍＬ）， 相应减少同体积水，其余同邻苯三酚自氧化，测定加 样后自氧化速率 。 清除超氧阴离子能力计算公式： 清除率＝（△Ａ０一△Ａ１）／Ａ ０×１００％ 式中：△Ａ。为邻苯三酚自氧化速率；ＡＡ 为加样后 邻苯三酚自氧化速率。 １．３．５模拟人体胃液条件下亚盐清除率的测定 １．３．５．１亚钠标准曲线的建立 分别吸取０、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０、１．０、１．５、２．０、 ２．５ ｍＬ亚钠标准使用液（相当于０、１、２、３、４、５、 ７．５、１０、ｌ２．５ ｇ亚钠），置于２５ ｍＬ比色管中，各 加人ｐＨ ３．０的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液２ ｍＬ，在 ３７℃水浴１ ｈ，取出，立即加入０．４％对氨基苯磺酸 ２．０ ｍＬ混匀，静置３ ｍｉｎ～５ ｍｉｎ，后各加１．０ ｍＬ ０．２％盐 酸萘乙二胺溶液，加水至刻度混匀，静置１５ ｍｉｎ，在 ５３８ ｎｍ下测定吸光度，建立回归方程。 １．３．５．２不同反应浓度的亚盐清除率测定 ｐＨ ３．０的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液２．０ ｍＬ，分 别加人不同浓度（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍｇ／ｍＬ）的样 液１．０ ｍＬ，５ ｔｘｇ／ｍＬ的亚钠标液２．０ ｍＬ于２５ ｍＬ 比色管中，在３７℃水浴１ ｈ，取出，立即加入０．４％对氨 基苯磺酸２．０ ｍＬ，混匀，静置３ ｍｉｎ～５ ｍｉｎ，后各加 １．０ ｍＬ ０．２％盐酸萘乙二胺溶液。加水至刻度混匀，静 置１５ ｍｉｎ，以同浓度的样品溶液做对照，在５３８ ｎｍ下 测定吸光度，同时用Ｖ 做对照实验。在标准曲线上查 ｎ 出亚钠的残留量（￣ｇ／ｍＬ）。 亚盐清除率＝（Ⅳ空一Ⅳ残）／Ｎ牵×１００％ 式中：Ⅳ率为空白管的亚钠残留量，（ｗｇ／ｍＬ）； Ⅳ残为样品管的亚钠残留量，（￣ｇ／ｍＬ ｏ １．３．５－３不同反应时间的亚盐清除率测定 ｐＨ３．０的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液２．０ ｍＬ，分别 加入０．２ ｍｇ／ｍＬ的样式液１．０ ｍＬ，５￣ｇ／ｍＬ的亚钠 标液１．０ ｍＬ于２５ ｍＬ比色管中，分别放置３７％水溶 ２０、４０、６０、８０、１００ ｍｉｎ，取出后按照１．３．５．２方法计算清 除率。 １．３．６模拟人体胃液条件下不同反应浓度对亚硝胺合 成阻断率的测定ｎ３＿ ４】 １＿３．６．１不同反应浓度的亚硝胺合成阻断率测定 分别吸取不同浓度（０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍＣｍＬ） 的样液１．０ ｍＬ于２５ ｍＬ比色管中。加入ｐＨ ３．０的柠 檬酸一磷酸氢二钠缓冲液１０．０ ｍＬ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＮＯ２溶液１．０ ｍＬ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ的二甲胺溶液１．０ ｍＬ， 用蒸馏水稀释至刻度，在３７ ｑＣ下恒温１ ｈ。用移液管 吸取１．０ｍＬ上述溶液加到５０ｍＬ小烧杯中，加人质 量分数０．５％Ｎａ２ＣＯ： 溶液０．５ ｍＬ，于紫外分析仪上照 １５ ｍｉｎ。取出后加入质量分数１％对氨基苯磺酸 １．５ ｍＬ，再加入质量分数０．１％ 一萘胺１．５ ｍＬ，蒸馏 水０．５ ｍＬ，摇匀静置１５ ｍｉｎ。用分光光度计在确定的 最大吸收波长５２５ ｎｍ处测吸光度。同时用Ｖ 做对照 实验。计算阻断率。 阻断率＝（Ａ。一Ａｉ）／Ａ ０×１００％ 式中：Ａ 为未加样液时的吸光度值（以试剂空白 溶液为参比溶液）；Ａｉ为加入样液后的吸光度值（以同 浓度样液为参比溶液）。 １．３．６．２不同反应时间的亚硝胺合成阻断率测定 吸取０．５ ｍｇ／ｍＬ的样液１．０ ｍＬ于２５ ｍＬ比色管 中。加入ｐＨ３．０的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液１０．０ ｍＬ， １ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＮＯ２溶液１．０ ｍＬ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ的二甲胺溶 液１．０ ｍＬ，用蒸馏水稀释至刻度，在３７℃下分别恒温 ２Ｏ、４０、６０、８０、１００ ｍｉｎ。用移液管吸取１．０ ｍＬ上述溶液 按照１．３．６．１方法计算阻断率。 ２结果与分析 ２．１山竹壳提取物中总黄酮的含量 芦丁标准曲线的制备：以芦丁标液浓度为横坐 标，吸光度值为纵坐标作 关于Ｙ的函数图像，所得图 像为一次函数图像（如图１所示。将所得数据做回归 处理，得其相关的回归方程，ｙ＝ｌ１．５５７ｘ＋０．０００ ２，Ｒ ＝ ０．９９９ ７，在０～０．０４ ｍｇ／ｍＬ范围内呈良好的线性关系。 王晓波，等：山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 基础研究 １２ ０ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ 卯 ∞：会∞ 加 ｍ：ｇ ０ ２ Ｕ ０．０ｌ Ｕ．０２ ０．０３ ０．０４ ０．０５ 芦丁标液浓度／（ｍｇ／ｍＬ） 图１芦丁标准曲线 Ｆｉｇ．１ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｔｗｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｕｔｉｎ 按照１．３．１方法测得提取物中总黄酮的吸光度 ０．２４５，于标准曲线查得其浓度Ｏ．０２１ １８ ｍｇ／ｍＬ，通过 １．３＿３中的公式计算得出山竹壳提取物中总黄酮的含 量为４２．３６％。 ２．２山竹壳总黄酮的抗氧化作用 山竹壳总黄酮对羟自由基、超氧阴离子的清除作 用结果见表１。 表１山竹壳总黄酮对自由基清除能力 Ｔａｂｌｅ １ Ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ 项目 ＩＣｍ浓度／（ｍｇ／ｍＬ） 羟自由基 超氧阴离子 表１结果表明，山竹壳总黄酮对羟自由基、超氧阴 离子自由基具有一定的清除作用，其清除能力弱于 Ｖ ，稍弱于芦丁。山竹壳总黄酮对自由基的清除羟自由 基的清除大于超氧阴离子，且与浓度呈现正相关，这 可能与黄酮类化合物上存在酚羟基活性基团，通过酚 羟基与自由基反应形成稳定半醌式自由基发挥清除 自由基抗氧化作用，而且不同的黄酮类化合物对不同 自由基的作用存在一定的选择性有关 。 ２．３山竹壳总黄酮对亚硝化反应的抑制作用 ２．３．１模拟人体胃液条件下亚盐清除率 ２．３．１．１亚钠标准曲线 以亚钠含量为横坐标 ，吸光度值为纵坐标 Ｙ，做一次函数图像（见图２），将所得数据做回归处理， 得其相关的回归方程，ｒ：ｏ．０２８９ｘ＋０．００２４，Ｒ ０．９９９６，在 ０～１２．５ ｇ范围内呈良好的线性关系。 ２．３．１．２不同反应浓度的亚盐清除率 按照１．３．５．１公式计算处理数据，不同浓度的Ｖ ．ｏ０２４ ６ ０ ５ １０ １５ 亚钠含量／ ｇ 图２亚钠标准曲线 Ｆｉｇ．２ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒｉｔｅ 和山竹壳总黄酮对亚盐的清除作用结果见图３。 粪 ０ ０．１ ０．２ ０．３ ０．４ ０．５ ０．６ 浓度／（ｍｇ／ｍＬ） 图３不同浓度Ｖｆ和山竹壳总黄酮对亚盐清除率的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｔｏｔａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｖｃ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ 由图３可知，山竹壳总黄酮对亚盐具有清除 作用，且清除率在实验浓度的范围内随浓度增加而增 加，起始增幅较大，后来增幅缓慢。当山竹壳总黄酮的 浓度为０．３ ｍｇ／ｍＬ时，对亚盐的清除率为６４．６５％， 与同等条件下浓度为０．５ ｍ＃ｍＬ Ｖ 的清除率相当，当 山竹壳总黄酮的浓度为０．５ ｍ＃ｍＬ时，对亚盐的 清除率可达６９．９２％，大于同等条件下Ｖ 对亚盐 的清除率。说明在模拟人体胃液条件下，山竹壳总黄 酮能有效地清除亚盐，其清除亚盐的能力略 优于Ｖ 。 ２．３．２模拟人体胃液条件下亚硝胺合成阻断率 根据１．３．６计算处理数据，不同浓度的Ｖ 和山竹 壳总黄酮对亚硝胺合成的的阻断作用结果见图４。 由图４可知，山竹壳总黄酮对亚硝胺合成具有阻 断作用，阻断率在实验浓度的范围内随浓度增加而增 加。当山竹壳总黄酮的浓度为０．６ ｍｇ／ｍＬ时，对亚硝 胺合成的阻断率为５３．７２％，与同等条件下浓度为 １．０ ｍｇ／ｍＬ Ｖ 的阻断率相当，当山竹壳总黄酮的浓度 为１．０ｍｇ／ｍＬ时，对亚硝胺合成的阻断率可达６６．１２％， 大于同等条件下ｖ 对亚盐的清除率。说明在模拟 人体胃液条件下，山竹壳总黄酮能有效地阻断亚硝胺 基础研究 王晓波，等：山竹壳总黄酮抗氧化及抑制亚硝化作用研究 ｌ ３＝＝＝＝．Ｉ 癌症的有效途径，因此，进一步研究山竹壳的有效成 分及其功能，将对有效防治癌症具有一定的价值，同 时将山竹壳变废为宝，为资源循环利用和山竹进一步 开发利用起促进作用。 岛 参考文献： Ｏ Ｏ．２ ０．４ ０．６ ０．８ １．０ １．２ ［１］Ｍｏｏｎｇｋａｍｄｉ Ｋｏｓｅｍ Ｎ，ＫａｓｌｕｒＩｇｋａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ａｕｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｔｉｏｘ— 浓度／（ｍ￣ｍＬ） 图４不同反应浓度Ｖ 和山竹壳总黄酮对亚硝胺合成阻断率的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍａｎｇｏｓｔｅｅｎ ｓｈｅｌｌ ｔｏｔａｌ ｌａｙｏｎｏｉｄｓ ｆａｎｄ Ｖｃ ｏｎ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ（ｍａｎｇ０ｓ— ｔｅｅｎ）ｏｎ ＳＫＢＲ３ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ￣］．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００４，９０（１）：１６１－１６６ ［２］赵佳．山竹黄酮的提取、合成、分析及性质研究【Ｄ］．陕西：西北大 学．２００８：１－３０ 合成，且与浓度呈现正相关，其阻断亚硝胺合成的能 力略优于Ｖ 。其作用机理可能与清除亚盐有关， ［３］卢志强，娄红祥．植物活性成分与癌症的化学预防【Ｊ】．中草药，２００２， ３３（６）：５６３—５６６ 由于亚盐是合成亚硝胺的前体物质，因此清除亚 盐可以间接减少亚硝胺的合成。 ３结论 ［４］闫向阳，刘建平，夏季红，等．甘草黄酮提取条件的优化及抑制亚 硝化反应的研究『Ｊ１＿河南工业大学学报：自然科学版，２００７，２８（２）： ３５—３７ ［５］田迪英，杨荣华，王琪，等．红薯不同部位抑制亚硝化反应能力及 总黄酮含量比较［Ｊ】．食品与发酵工业，２００７，３３（３）：８—１ １ ［６］田新玲，晏佩霞，仝殿荣．分光光度计法测定天然植物中黄酮含 ３．１山竹壳总黄酮的含量 本实验使用超声辅助乙醇浸提法对山竹壳总黄 酮 彳亍提取。以８０％乙醇为提取液，料液比为１：１０（ｇ／ｍＬ）， 量［Ｊ】＿仪器仪表与分析监测，２００３（３）：２５—２６ ［７】李睿，温志忠，鲁琛琛，等．冬青叶中黄酮化合物提取工艺『ＪＩ．应用 化工。２００９。３８（３）：４１２—４１４ 提取２次，并经石油醚脱脂，该条件下提取出的山竹壳 提取物中黄酮类化合物的含量为４２．３６％。 ［８］王锁义，罗建华，张丽丹，等．茉莉花茎总黄酮提取及对羟自由基 清除作用［Ｊ１．时珍国医国药，２００８，１９（３）：５９２—５９３ ３．２山竹壳总黄酮的抗氧化作用 山竹壳总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基 具有一定的清除作用，且在实验的浓度范围呈现出良 好的量效关系，随着浓度增加清除率增大。其清除羟 ［９］刘宝剑，郭延生，鹏飞，等．红车轴草总黄酮体外清除自由基作 用的研究ｆＪ】．天然产物研究与开发，２００９，２１（１）：４４—４７ ［１０］韩少华，朱靖博，王妍妍．邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的 方法研究叫．中国酿造，２００９（＠１５５—１５７ 自由基和清除超氧阴离子自由基的能力弱于Ｖ ，稍弱 于芦丁。结果表明，山竹壳总黄酮具有一定的抗氧化 作用，且属天然产物，因此在抗氧化剂的方面具有潜 在的开发利用价值。 ３．３山竹壳总黄酮对亚硝化反应的抑制作用 在模拟人体胃液的条件下（ｐＨ ３．０、温度３７。【＝）， 山竹壳总黄酮能有效地清除亚盐和阻断亚硝胺 合成，具有剂量一反应关系，且能力略优于Ｖ 。 本实验研究结果表明山竹壳提取的总黄酮对羟 自由基、超氧阴离子自由基具有清除作用，其清除能 力弱于Ｖ ，并能有效地清除亚盐和阻断亚硝胺的 合成，清除体内亚盐和阻断亚硝胺的合成是防治 【１ １］赵二劳，张海容．沙棘黄酮的测定及其抗氧化作用ｆＪ１．化学研究与 应用，２００３，ｉ５（２）：２８４—２８６ ［１２］中华人民共和国卫生部．ＧＢ ５００９．３３—２０１０食品安全国家标准 食品中亚盐与盐的测定 ．北京：国家标准出版社， ２０１０：４—１０ ｆｌ３】陈冬丽，黄俊生．南姜清除亚盐及阻断亚硝胺合成的研究 叨．中国调味品，２０１０，３５（５）：５９—６１ ［１４］赵二劳，王晓妮，张海容，等．山楂清除亚盐及阻断亚硝胺合 成的研究【ＪＪ．食品与发酵工业，２００６，３２（１０）：２９—３１ ［１５】ＣＨＥＮ Ｊ Ｗ，ＺＨＵ Ｚ Ｑ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｌｆａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ—ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ『Ｊ】．Ａｃｔａ Ｐｈａｒ２ ｍａｃｏｌ Ｓｉｎ，２００２，２３（７）：６６７－６７２ 收稿日期：２０１２—０８—２０
