利用HPLC-ESI-MS技术测量硒代氨基酸

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来源：《中国食品》 2019年第5期

硒在自然界中以无机硒和有机硒的形式存在,有机硒又多以硒代氨基酸的形式存在。富硒食品和饲料添加剂作为硒补充来源,通过研究HPLC-ESI-MS技术测量硒代氨基酸,可以为富硒作物的开发利用提供技术手段。

一、有机硒的存在形式

植物中有机硒主要有硒蛋白、硒核糖核酸以及含硒多糖等,其中,硒蛋白是大分子有机硒的主要形态,硒的抗氧化作用主要就是以硒蛋白和硒酶等形式发挥的。在生物硒丰富的产品中,硒是以硒蛋白、硒多糖和硒核酸的形式存在,其中硒蛋白的比例最高。硒被摄入和吸收后,起到了营养和治疗作用,这些作用直接依赖于硒蛋白的生物代谢系统。在硒代氨基酸中,硒的形式是硒由共价键结合连接到蛋白,例如硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸等。现有研究中,Montes-bayón等通过对富硒大蒜和油菜的研究证明了硒以硒代半胱氨酸(selenocysteine,Se-Cys2)和硒代蛋氨酸(selenomethionine, Se-Met)两种形式存在。在生物富硒产品的开发和应用中,硒形态的分析主要集中在硒代氨基酸和代谢物。目前已经有很多关于硒蛋白中硒代氨基酸的不同提取工艺及测定方法,这些方法具有不同的灵敏度和范围,所以采用正确和精确的方法检测富硒食品中的硒代氨基酸是至关重要的。

二、提取硒代氨基酸的方法

目前分离提取硒代氨基酸有两种常用方法:酶解法和水提法。酶解法是将在最优条件下提取出的蛋白质进行酶解形成小分子的硒代氨基酸及其它氨基酸,具有杂质少、谱图清晰易于分辨的特点。水提法通过适温水提取样品中游离的硒代氨基酸和蛋白,再加入适量的酶使蛋白解离从而产生硒代氨基酸,具有操作简单、实验周期短的优点,但杂质较多,谱图较杂。

三、利用HPLC-ICP-MS

检测样品中的硒代氨基酸

电喷雾质谱法(ESI-MS)的基本原理是在液相色谱(LC)的毛细管出口处施加高电压,从而产生的电场使液体雾化成带电小液滴;随着溶剂蒸发,液滴的表面积减少和电荷密度增加,使得液滴,最终导致分析物以单或多电荷离子的形式进入气相;根据离子的荷质比,得到相应的质谱图。电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)一般与各种分离技术结合使用,而ESI-MS具有低检测灵敏度,容易受到基体的干扰,所以在ESI-MS分析中样品的浓度和纯化是必要的。如果在样品中发现未知硒化合物,ESI-MS则与分离技术结合识别未知的化合物。酵母中的硒腺苷高半胱氨酸、芥菜根中的甲基硒代蛋氨酸、大葱中的γ谷氨酰硒-甲基硒代半胱氨酸、蘑菇中的硒代蛋氨酸、大鼠肝细胞代谢物中的硒-甲基硒代半胱氨酸,都是用HPLC-ICP-MS和ESI-MS来鉴别。

近几年,通过HPLC-ESI-MS定量分析硒代氨基酸已经有所发展,主要是用乙醚通过

LC/ESI/MS衍生乙氧基的方法来识别和确定Se-Met和硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeSeCys)。校准曲线的线性范围在0.32pmol-49pmol的是蛋氨酸,0.34pmol-40pmol的是Se-MeSeCys。这种方法可用于测定Se-MeSeCys和洋葱中的SeMet。除了低检测限,还可以确认分析物的身份并识别未知化合物。衍生作用是提高LC/ ESI/MS检测的灵敏度和选择性,提高色谱保留或峰形,消除交叉污染,促进样品净化,对于不稳定的分析物形成一个稳定的衍生物。

衍生化试剂丹磺酰氯,p-N,N,N-三甲基氨基苯胺(P-N,N,N-trimethylammonioanilylN)以及羟基琥珀氨基甲酸酯通常用于氨基酸的LC/ESI/MS分析。乙氧甲叉

(diethylethoxymethylenemalonate)与复杂的洋葱基质混合不会抑制SeMet和Se-MeSeCys衍生物的信号,同时复杂基质中衍生收益率的问题也证实了可以通过稀释基质降低基质的效果。对大豆的研究表明,通过选择多反应监测(MRM)模式下监控,LC/ESI/MS是一个敏感并精确的定性定量测定Se-MeSeCys和SeMet形态的方法。除了衍生,通过选择前体离子m/z和其连续产物离子的m/z,MRM模式也提高了LC/ESI/MS的灵敏度和准确度。总之,LC/ESI/MS和LC-ICP-MS具有相似的灵敏度和鉴定。结合样品深化发展的处理和富集方法,LC/ESI/MS将用于定性定量测定更多的硒代氨基酸。